ГОСТ 32641-2014 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Определение токсичности при повторном/многократном пероральном поступлении вещества на грызунах. 28-дневный тест (Переиздание)

     4 Описание метода

4.1 Животные
     

    4.1.1 Выбор видов животных

Предпочтительным видом подопытных животных являются крысы, хотя возможно использование прочих видов грызунов. Если параметры, определяемые настоящим стандартом, тестируются на других видах грызунов, необходимо предоставить подробное обоснование такого выбора. С биологической точки зрения вероятно, что другие виды животных будут реагировать на ядовитые вещества аналогично крысам, однако применение более мелких видов может привести к увеличению вариабельности из-за технической сложности препарирования более мелких органов. При проведении международной программы валидации для выявления эндокринных деструкторов в качестве подопытных животных применяли только крыс. В тестировании следует применять обычные лабораторные породы молодых здоровых половозрелых животных. Самки должны быть нерожавшими и небеременными. Введение доз вещества должно начинаться сразу же после отлучения от матери, но в любом случае до тог,о как животным исполнится девять недель. В начале исследования отклонение массы подопытных животных должно быть минимальным и не превышать ±20% средней массы особей обоего пола. В случае, если исследование проводится в качестве предварительного к долгосрочным исследованиям хронической токсичности, в обоих исследованиях должны использовать животных одной породы и одного и того же происхождения.

4.1.2 Условия содержания и кормления

Все процедуры должны соответствовать национальным стандартам обращения с лабораторными животными. Температура в помещении с подопытными животными должна составлять (22±3)°С. Несмотря на то что относительная влажность воздуха не должна быть ниже 30% и, желательно, не превышать 70% за исключением периода уборки помещения, целевое значение относительной влажности составляет от 50% до 60%. Освещение в помещении должно быть искусственное с чередованием 12 ч света, 12 ч темноты. В кормлении можно применять обычный лабораторный рацион с неограниченной подачей воды для питья. Выбор рациона может быть обусловлен необходимостью обеспечить соответствующую смесь тестируемого вещества при его введении в соответствии с настоящим методом. Животные должны содержаться в клетках небольшими группами особей одного пола; отдельное содержание животных возможно, если оно научно обосновано. При групповом содержании в одной клетке не должно быть более пяти животных.

Пища должна регулярно проверяться на содержание загрязняющих веществ. Образец пищи должен сохраняться до момента подготовки финального отчета.

4.1.3 Подготовка животных

Здоровые молодые половозрелые животные распределяются в контрольную и экспериментальную группы в произвольном порядке. Клетки с животными располагаются таким образом, чтобы свести к минимуму потенциальное воздействие размещения клеток. Каждому животному присваивается уникальный идентификационный номер. Все животные до начала исследования проходят акклиматизацию к лабораторным условиям на протяжении не менее пяти дней.

4.2 Подготовка доз вещества

Тестируемое вещество вводят через желудочный зонд, с пищей или с питьевой водой. Способ перорального введения зависит от цели исследования и физических/химических/токсико-кинетических свойств тестируемого вещества.

В необходимых случаях тестируемое вещество растворяют или суспензируют в подходящем растворителе. Рекомендуется при наличии возможности в первую очередь применять водный раствор/суспензию, затем масляный раствор/эмульсию (например, на основе кукурузного масла) и потом возможные растворы в прочих растворителях. Для любых растворителей, кроме воды, должны быть известны их токсические характеристики. Необходимо определить стабильность тестируемого вещества в условиях введения препарата.

4.3 Основное испытание

4.3.1 Число и пол животных

Для приема каждой дозы вещества применяют не менее 20 животных (10 самок и 10 самцов). Если запланировано промежуточное умерщвление, число подопытных животных должно быть увеличено на число животных, которых предусматривают умертвить до завершения исследования. Основываясь на предварительных знаниях о химическом веществе или его ближайшем аналоге, следует предусмотреть включение дополнительной сопутствующей группы из десяти животных (по пять особей каждого пола) в контрольную группу и группу, получающую максимальную дозу, с целью наблюдения после периода введения вещества за обратимостью, устойчивостью или замедленным проявлением токсического действия в течение не менее 14 дней после введения вещества.

4.3.2 Дозирование

Обычно применяют не менее трех тестируемых групп и одну контрольную группу, но если, основываясь на оценке прочих данных, никакого воздействия не ожидается при дозе 1000 мг/кг массы животного/сутки, возможно проведение испытания предельной дозы. При отсутствии достаточных данных возможно проведение исследования по поиску/подбору/определению диапазона доз (применяя животных одной породы и одного и того же происхождения) для того, чтобы определить необходимые дозы. Кроме введения тестируемого вещества, с животными контрольной группы следует обращаться так же, как и с тестируемыми группами. В случае применения растворителя контрольная группа должна получать его в максимальном объеме.

Уровни доз должны подбирать с учетом всех имеющихся данных о токсических и токсико-кинетических свойствах тестируемого вещества или его производных. Максимальная доза должна выбираться с целью вызвать токсическое воздействие, а не смерть или жестокие страдания животного. Поэтому убывающая последовательность уровней дозы должна подбираться с целью продемонстрировать реакцию на вводимую дозу и уровень отсутствия наблюдаемого вредного воздействия (NOAEL) при минимальной дозе. Часто двух- четырехкратный интервал является оптимальным для установления убывания уровней дозы, а добавление четвертой тестируемой группы бывает предпочтительным при применении очень больших интервалов (например, превышающий показатель 10) между дозировками.

При наблюдении общих признаков токсичности (например, снижение массы тела, поражение печени, сердца, легких или почек и т.д.) или прочих изменений, которые могут не являться ответной реакцией на токсическое воздействие (например, снижение потребления пищи, увеличение печени и т.д.), обнаруженное вредное воздействие на чувствительные иммунные, неврологические или эндокринные органы системы должны интерпретироваться с особой тщательностью.

4.3.3 Испытание предельной дозы

Если испытание одной дозы, составляющей не менее чем 1000 мг/кг массы животного/сутки, при введении вещества с пищей или питьевой водой, в эквивалентной доле в пище или питьевой воде (исходя из значения массы тела), с применением процедур, описанных в настоящем исследовании, не приводит к наблюдаемому неблагоприятному воздействию, и если токсичность не предполагается исходя из данных о структурно-родственных веществах, проведение полного исследования с применением трех уровней дозы может быть необязательным. Испытание предельной дозы проводится за исключением тех случаев, когда воздействие на человеческий организм указывает на необходимость применения более высоких доз вещества.

4.3.4 Введение доз вещества

Животным вводятся дозы тестируемого вещества ежедневно, семь дней в неделю, в течение 28 дней.

При введении тестируемого вещества с принудительным питанием вещество следует вводить животным в однократной дозе, применяя желудочный зонд или подходящий интубационный катетер. Максимальный объем жидкости, который может быть введен за один раз, зависит от размера подопытного животного. Этот объем не должен превышать 1 мл/100 г массы тела за исключением случаев с водными растворами, когда можно применять объем из расчета 2 мл/100 г массы тела. Кроме вызывающих раздражение или разъедающих веществ, которые в обычных условиях проявляют усугубляющее действие при повышенных концентрациях, вариабельность объема тестируемого вещества следует сводить к минимуму путем коррекции концентрации вещества, обеспечивая постоянный объем для всех уровней доз.

Для веществ, вводимых с пищей или питьевой водой, важно обеспечить, чтобы применяемое количество тестируемого вещества не нарушало обычного питания или водного баланса. При введении тестируемого вещества с пищей можно применять постоянную концентрацию пищи (мг/л) или постоянную дозу в пересчете на массу тела животного; при применении альтернативного варианта должно быть приведено его подробное описание. Для вещества, вводимого через желудочный зонд, дозу следует вводить ежедневно в одно и то же время, корректируя ее по мере необходимости для поддержания постоянного уровня дозы в пересчете на массу тела животного. В случае, когда исследования многократного применения вещества являются предварительными перед долгосрочным исследованием, в обоих исследованиях должны применять аналогичный пищевой рацион.

4.4 Результаты наблюдений

Период наблюдений должен составлять 28 дней. Животные в сопутствующей группе, предназначенные для последующего наблюдения, должны содержаться в течение периода не менее 14 дней без введения тестируемого вещества с целью выявления замедленного проявления или устойчивости токсического действия или восстановления от токсического воздействия.

Общие клинические наблюдения должны проводить один раз в день, желательно в одно и то же время, с учетом пикового периода предполагаемого действия после введения дозы вещества. Состояние здоровья животных должно фиксироваться документально. Не реже двух раз в сутки, как правило, утром и вечером всех животных проверяют на признаки клинических проявлений заболевания и летальность.

Один раз до первого воздействия (для внутригрупповых сравнений) и хотя бы один раз неделю спустя должны проводить подробные клинические наблюдения всех животных. Такие наблюдения следует проводить вне жилой клетки, желательно в стандартной обстановке и в одно и то же время. Результаты наблюдений должны быть тщательно задокументированы, желательно с применением системы бальной* оценки, четко определенной лабораторией, проводящей тестирование. Следует принять меры, обеспечивающие минимальные отклонения в условиях наблюдений, а также проведение наблюдений специалистами, которые не знают о введенном веществе. Отмечаемые признаки должны включать в себя, но не ограничиваться, изменения кожи, меха, глаз, слизистых оболочек, наличие выделений или экскреции и автономной деятельности (например, слезотечение, пилоаррекция, изменение размера зрачков, необычная дыхательная деятельность). Изменения походки, положения тела и реакции на обращение, а также наличие клонических или тонических движений, стереотипного (например, избыточная чистка шерсти, повторяющееся движение по кругу) или необычного поведения (например, нанесение себе увечий, хождение пятясь задом) также должны документироваться [3].