ГОСТ 32638-2014 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Метод оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro

     3 Принцип исследования

Клетки, дефицитные по тимидинкиназе (ТК) вследствие мутации ТК+ ТК-, резистентны к цитотоксическому эффекту пиримидинового аналога трифтортимидина (ТФТ). Клетки, профицитные по тимидинкиназе, чувствительны к ТФТ, который вызывает ингибицию клеточного метаболизма и останавливает клеточное деление. Только мутантные клетки способны пролиферировать в присутствии ТФТ, в то время как содержащие тимидинкиназу нормальные клетки не пролиферируют. Аналогично клетки, дефицитные по HPRT или XPRT, отбираются по резистентности к 6-тиогуанину (ТГ) или 8-азагуанину (АГ). При тестировании генных мутаций in vitro следует тщательно анализировать особенности исследуемых веществ, не являются ли они аналогами оснований или соединениями, связанными с селективными агентами, используемыми в данной тест-системе. Например, любая ожидаемая селективная токсичность исследуемого соединения должна изучаться для мутантных и немутантных клеток. Приемлемость отбора система/агент должна быть подтверждена, когда исследуемое соединение по химической структуре связано с селективным агентом.

Клеточная суспензия или клеточный монослой подвергаются воздействию исследуемого соединения как в варианте с, так и без метаболической активации в течение адекватного интервала времени и затем субкультивируются для определения цитотоксичности и фенотипической экспрессии до отбора мутантов [10], [11], [12], [13], [14]. Цитотоксичность обычно оценивается по соотношению эффективности клонирования (выживаемости) или по соотношению общего роста культур после воздействия. Обработанные культуры содержат в культуральной среде необходимый период времени, характерный для каждого селективного локуса и клеточного типа, чтобы проявилась близкая к оптимальной фенотипическая экспрессия индуцированных мутаций. Частота мутаций определяется путем посева определенного числа клеток в содержащую селективный агент культуральную среду для выявления мутантных клеток и в среду без селективного агента для определения эффективности клонирования (выживаемости). После соответствующего времени инкубации подсчитывают колонии. Частота мутаций определяется из числа колоний в селективной среде и числа колоний в неселективной среде.