ГОСТ 32635-2014 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro (Переиздание)

Введение

Микроядерный тест in vitro (МЯТ) - метод оценки генотоксичности по выявлению микроядер в цитоплазме интерфазных клеток. Микроядра могут образовывать ацентрические фрагменты хромосом (т.е. с отсутствием центромеры) или целые хромосомы, которые не способны мигрировать к полюсам на стадии анафазы клеточного деления. Метод оценивает кластогенную и анеугенную активность химических веществ [2, 3] в клетках, которые проходят клеточное деление во время или после экспозиции исследуемого вещества. Данное руководство касается использования протоколов без или с применением ингибитора актин полимеразы цитохолазина В (ЦХБ)*. Добавление ЦХБ* перед изучаемым митозом позволяет идентифицировать и проводить анализ частоты микроядер в клетках, которые прошли один митоз, т.к. такие клетки двуядерны [4, 5]. Это руководство также дает описание протокола без блока цитокинеза при условии наличия данных, что анализируемая клеточная популяция митотически активна.

__________________

* Текст документа соответствует оригиналу. Далее по тексту в бумажном оригинале приводится обозначение ЦХВ. - Примечание изготовителя базы данных.  

В дополнение к использованию МЯТ для идентификации индуцирующих микроядра химических веществ, цитокинезный блок, иммунохимическое мечение кинетохоров или гибридизация с центромерными/теломерными зондами [флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)] позволяют получить информацию по механизмам хромосомных нарушений и образования микроядер [6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17]. Процедуры мечения и гибридизации можно использовать в случаях, когда имеется повышение образования микроядер и исследователь хочет выяснить, является ли это возрастание результатом кластогенных и/или анеугенных событий.

Микроядра представляют собой нарушения хромосом, которые передаются дочерним клеткам, тогда как аберрации хромосом, анализируемые в метафазных клетках, могут не передаваться. Поскольку выявление микроядер в интерфазных клетках достаточно объективно, сотрудникам лабораторий необходимо определить прошла или не прошла клетка клеточное деление и как много клеток содержит микроядра. В результате анализ препаратов проводится относительно быстро и может быть автоматизирован. На практике это позволяет анализировать тысячи, а не сотни клеток на экспериментальную точку, увеличивая силу метода. Наконец, поскольку микроядра могут образовывать отставшие хромосомы, возникает возможность выявлять агенты, индуцирующие анеуплоидию, что трудно оценивать в стандартном тесте на хромосомные аберрации (например, Руководство OECD 473 [18]). Однако МЯТ не позволяет выявлять вещества, индуцирующие полиплоидию, от веществ, которые индуцируют кластогенность, без специальных методик, таких как FISH.

МЯТ является методом in vitro, который проводится на культивируемых клетках человека и грызунов. Тест дает полное основание исследовать хромосомные нарушения in vitro, поскольку выявляет как анеугены, так и кластогены.

МЯТ надежен и эффективен в различных типах клеток как в присутствии, так и отсутствии ЦХВ. Имеется большое количество данных, показывающих приемлемость МЯТ при использовании различных линий клеток грызунов (СНО, V79, CHL/IU и L5178Y) и лимфоцитов человека [19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32]. Они включают Международное исследование по валидации теста, координируемое the Francaise de Toxicologie (SFTG) [19, 20, 21, 22, 23] и доклады Международных совещаний по генетическому тестированию [5, 17]. Все приемлемые данные были также повторно оценены в weight-of-evidence ретроспективном валидационном исследовании Европейского центра по валидизации альтернативных методов (ECVAM) Европейской комиссии (ЕС). Метод тестирования был рекомендован как научно обоснованный ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) [33, 34, 35]. Имеются данные по использованию клеточной линии лимфобластных клеток человека ТК6 [36], HepG2 клеток [37, 38] и первичных эмбриональных клеток сирийского хомячка [39], хотя они не проходили валидизационное исследование.