ГОСТ Р ИСО 21571-2014 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот

     5.2 Экстракция и очистка ДНК

5.2.1 Общие положения

При разработке методов выделения ДНК необходимо учитывать следующие требования.

Качество и выход экстрагированной нуклеиновой кислоты при использовании того или иного метода для того или иного продукта должны быть как повторяемыми, так и воспроизводимыми при условии содержания достаточного количества нуклеиновой кислоты в анализируемой пробе, из которой она была выделена.

Для получения ДНК хорошего качества рекомендуется при необходимости удалить следующие компоненты:

- полисахариды (пектин, целлюлозу, гемицеллюлозу, крахмал, загустители и т.д.) путем обработки соответствующим ферментом (например пектиназой, целлюлазой, гемицеллюлазой, -амилазой) или экстрагирования органическим растворителем (например гексадецилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ)/хлороформ);

- рибонуклеиновые кислоты (далее - РНК) и/или белки путем соответствующей обработки, например ферментативной обработки рибонуклеазой и протеиназой соответственно;

- липидные фракции путем ферментативной обработки или использования растворителей (например гексана);

- солей (например из буфера для выделения и лизиса, добавляемых в раствор на стадии осаждения), способных оказывать влияние на последующий анализ.

В частности, в случае твердых или высушенных проб объем буфера для выделения и лизиса должен быть таким, чтобы гарантировать растворение в нем ДНК.

Примечание - Очистка ДНК может выполняться различными способами, например путем фракционного осаждения с использованием таких растворителей, как фенол, хлороформ, этанол, изопропанол, и/или с использованием адсорбции на твердые матрицы (ионообменную смолу, силикагель или жидкое стекло, диатомовую землю, мембраны и т.д.). Можно объединить несколько принципов очистки ДНК. При необходимости выделение и очистка могут совмещаться путем выполнения на одном и том же этапе.

В случае использования соосадителей ДНК, например гликогена, полиэтиленгликоля (ПЭГ), транспортной РНК (т-РНК), для увеличения выхода ДНК в ходе стадий осаждения они не должны обладать нуклеазной активностью (содержать детектируемый уровень нуклеаз), содержать ингибиторы и/или конкуренты ПЦР или последовательности нуклеиновых кислот, гомологичные анализируемым последовательностям. При выделении ДНК из генетически модифицированных растений в качестве соосадителя может быть использована ДНК-носитель, например ДНК из спермы лосося или сельди.

При использовании сублимационных сушилок для высушивания осадка ДНК, полученного после стадии осаждения, необходимо учитывать риск перекрестного загрязнения.

Необходимо повторно растворяют ДНК в воде или буферном растворе для предотвращения деградации ДНК.

Пример - Для ресуспендирования или разбавления ДНК пригоден трис/ЭДТА (1или 0,1) с 8,0 ед. рН.

При применении нового метода выделения ДНК или одного из методов, описанных в приложении А, для новых продуктов потенциальные качество и целостность выделенной ДНК с использованием выбранного метода должны быть проверены следующим образом: путем добавления в лизирующий буфер известного количества меченой ДНК вместе с пробой, из которой необходимо выделить ДНК. Если оценка нового метода производится на основании использования меченой ДНК, количество (масса) которой известно, или подсчета количества копий определенной последовательности ДНК, необходимо оценить возможную перекрестную реактивность такой ДНК с ДНК, содержащейся в исследуемой пробе.

Примечание - Использование меченой ДНК является наилучшим приближением к реальной ситуации, когда предполагается образование комплекса ДНК данного продукта с другими компонентами (например белками). Такой метод также может использоваться для оценки присутствия растворимых ингибиторов ПЦР в выделенной ДНК (см. ИСО 24276, ИСО 21569 и ИСО 21570).

Однако меченая ДНК может привести к ложному представлению о степени извлечения ДНК, так как она может гораздо легче выделяться из продукта, чем целевая ДНК.

5.2.2 Процедуры контроля

Процедуры контроля, подлежащие использованию при проведении анализа, описаны в таблице 1 ИСО 24276. Они должны включать, как минимум, отрицательный и положительный контроли экстрагирования, а также могут включать контроль окружающей среды.

5.2.3 Контроль чистоты ДНК. Внутренний контроль ПЦР

При отработке нового метода экстрагирования присутствие ингибиторов ПЦР в экстрагированной ДНК может быть оценено с помощью внесения чужеродной ДНК (внутренний стандарт, см. ИСО 24276, ИСО 21569 и ИСО 21570). Количество добавленной ДНК не должно превышать максимальный уровень, допустимый для применяемой системы ПЦР, и должно содержать установленное число копий последовательности целевой ДНК. Это число необходимо определять отдельно для каждой последовательности целевой ДНК и указывать как кратное нижнему пределу обнаружения. В идеальном случае концентрация целевой ДНК в ПЦР при положительном контроле должна соответствовать чувствительности, требуемой для анализа. При использовании в качестве положительного контроля ПЦР высококонцентрированной клонированной целевой последовательности ДНК необходимо соблюдать осторожность из-за высокой опасности перекрестного загрязнения. По возможности нуклеиновые кислоты положительного контроля должны максимально соответствовать параметрам нуклеиновых кислот исследуемого материала.