ГОСТ Р ИСО 21571-2014 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот
5.3 Количественная оценка экстрагированной ДНК
5.3.1 Общие положения
Качество, целостность и количество экстрагированной нуклеиновой кислоты оказывают влияние на рабочие характеристики аналитического метода и, следовательно, на полученные аналитические результаты. Предел обнаружения конкретного метода может, таким образом, зависеть от количества использованных нуклеиновых кислот. Необходимо определить общее количество ДНК, которое используется в ПЦР, равно как и общее количество ДНК целевого таксона, так как ДНК нецелевого таксона может повлиять на эффективность ПЦР. |
Количественная оценка ДНК помогает:
- при определении эффективности различных методов выделения ДНК для определенного вида объектов (повторяемость);
- измерении концентрации нуклеиновых кислот перед анализом.
5.3.2 Область применения
Каждый метод количественной оценки должен применяться в пределах его динамического диапазона с учетом уровня точности измерения.
5.3.3 Количественные стандарты
Точность методов количественной оценки зависит от стандартов нуклеиновых кислот, используемых для калибровки метода.
При использовании метода, чувствительного к размеру и/или качеству фрагментов нуклеиновой кислоты, должны применяться стандарты нуклеиновой кислоты, которые соответствуют ожидаемым размеру и/или качеству нуклеиновой кислоты, экстрагированной из пробы.
Используемый контрольный материал (национальный или международный стандартный образец) должен обеспечивать проявление заявленных характеристик по непрерывной цепи при сравнении со стандартами национального или международного эталона (см. Руководство ИСО 30).
При применении метода с использованием интеркалирующих (встраивающихся в ДНК) агентов необходимо применять стандарт ДНК с высокой молекулярной массой, если количественной оценке подлежит ДНК с высокой молекулярной массой. Соответственно необходимо использовать стандарт ДНК с низкой молекулярной массой при количественной оценке ДНК с низкой молекулярной массой. Нуклеиновая кислота с высокой молекулярной массой, как правило, содержит некоторое количество фрагментов с более низкой молекулярной массой. Это означает, что многие методы количественной оценки ДНК имеют определенную степень неточности, которую необходимо учитывать при оценке результатов.
Примечание - Кроме того, в зависимости от исследуемого материала и применяемого метода выделения некоторая часть ДНК может быть извлечена в виде одноцепочечной ДНК (которая имеет гораздо более низкую способность к интеркаляции), что приводит к занижению общего содержания ДНК. С другой стороны, одноцепочечная ДНК также хорошо обнаруживается путем физических измерений.
Для построения калибровочного графика требуется не менее трех точек, предпочтительно в нескольких повторностях. Количество стандартной ДНК, использованной для каждой точки калибровочного графика, зависит от чувствительности метода и динамического диапазона измерений.