ГОСТ Р ИСО 21571-2014 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот

     А.1 Получение применимой для ПЦР ДНК методами экстракции ДНК на основе фенола/хлороформа

    А.1.1 Основной метод на основе фенола/хлороформа

А.1.1.1 Общие положения

Настоящий метод является общепринятым (см. [5]) и применяется для экстракции ДНК из большой группы продуктов (см. А.1.1.8).

Фенол обычно подходит для деструкции нуклеаз и денатурации белка.

При исследовании листьев или зеленой массы растений (например, листьев цикория, высушенной люцерны) вместе с ДНК могут совместно осаждаться многие ингибиторы ПЦР. По этой причине могут возникнуть трудности, связанные с воспроизводимостью получения ДНК, амплифицируемой в ПЦР.

С учетом агрессивных и опасных свойств фенола в качестве альтернативы целесообразно применять методы экстрагирования ДНК, основанные на ЦТАБ и/или поливинилпирролидоне (ПВП) и/или на адсорбции диоксидом кремния.

А.1.1.2 Статус валидации

Этот метод широко применяется во всех областях биологии, агрономии и медицины на протяжении 40 лет, однако он никогда не подвергался оценке путем межлабораторных исследований для обнаружения ГМО в пищевых продуктах.

А.1.1.3 Принцип метода

Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия и высокой концентрации этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и последующее удаление загрязняющих примесей (например, липофильных молекул, полисахаридов и белков) и нуклеаз из водной фазы, содержащей ДНК, с помощью фенола и хлороформа. Заключительное осаждение этиловым спиртом концентрирует ДНК и удаляет соли и остаточный хлороформ. Критическим этапом метода является стадия лизиса [5].

А.1.1.4 Меры предосторожности

Работы с органическими реактивами необходимо выполнять в вытяжном шкафу.

А.1.1.5 Реактивы

А.1.1.5.1 Этиловый спирт (), 96%-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20°С.

А.1.1.5.2 Ледяная уксусная кислота, .

А.1.1.5.3 Калия ацетат, .

А.1.1.5.4 Соляная кислота, HCI, 37%-ная.

А.1.1.5.5 Изоамиловый спирт [].

А.1.1.5.6 Фенол, .

А.1.1.5.7 Хлороформ, .

А.1.1.5.8 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), .

А.1.1.5.9 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двукалиевая соль (), .

А.1.1.5.10 Калия гидроксид, KOH.

А.1.1.5.11 Калия хлорид, KCI.

А.1.1.5.12 Натрия додецилсульфат (SDS), .

А.1.1.5.13 Протеиназа К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

А.1.1.5.14 Рибонуклеаза-А, выделенная из бычьей поджелудочной железы, очищенная от ДНК, приблизительно 50000 ед./мг лиофилизата.

А.1.1.5.15 Уравновешенный фенол, >7,8 ед. рН