ГОСТ ISO 15163-2014 Молоко и молочные продукты. Сычужный фермент из сычугов телят и ферментный препарат из сычугов крупного рогатого скота. Определение содержания химозина и говяжьего пепсина методом хроматографии

Приложение А
(справочное)

Количественное определение молокосвертывающих ферментов в промышленных коагулянтах методом двойной иммунодиффузии

А.1 Общие требования

Цель данного метода - определение возможного наличия одного или нескольких из следующих шести коагулирующих ферментов: химозина, говяжьего пепсина, свиного пепсина, ферментов из Rhizomucor (Mucor) miehei, Rhizomucor (Mucor) pusillus и Cryphonectria (Endothia) parasitica в ферментных препаратах.

Примечание - Метод, рассматриваемый в данном приложении, является дополнением к методу определения содержания химозина и говяжьего пепсина в ферментных препаратах из сычугов телят и крупного рогатого скота, при условии, что этот метод позволяет установить, только ли химозин и говяжий пепсин присутствуют в таких экстрактах или в них также имеются наиболее распространенные молокосвертывающие ферменты (кроме химозина и говяжьего пепсина). В последнем случае хроматографический метод неприменим. Не все молокосвертывающие ферменты можно идентифицировать с помощью этого метода, однако идентификация наличия химозина и говяжьего пепсина и отсутствие наиболее распространенных заменителей сычужного фермента дают высокую уверенность в том, что анализируемый ферментный препарат является натуральным ферментным препаратом животного происхождения.

Данный метод применим: а) ко всем ферментам из говяжьих и свиных желудков, способствующим коагуляции, и b) к ферментам, способствующим коагуляции и произведенным в промышленных целях из особых штаммов грибов Rhizomucor (Mucor) miehei, Rhizomucor (Mucor) pusillus и Cryphonectria (Endothia) parasitica.

A.2 Принцип

В агарозной среде преципитация специфических антигенов-антител позволяет визуально определить наличие вышеуказанных ферментов в ферментных препаратах [10]. Первый шаг - наносят слой агарозы на пластинку. После затвердения агарозы в слое агарозного геля вырезают маленькие лунки, одни из которых заполняют антигеном в разных концентрациях, а другие - антисывороткой. Каждый из антагонистов мигрируют по направлению друг к другу (двойная иммунодиффузия) и образуются иммунные комплексы, которые преципитируют в полях геля и становятся видимыми как линии преципитации, когда относительные концентрации антигена и антисыворотки являются оптимальными.

А.3 Оборудование и химическая посуда

Используют обычное лабораторное оборудование и химическую посуду, в частности, нижеприведенные.

А.3.1 Стеклянные пластинки (10х10 см) или покрытая агарозой полиэфирная пленка "Gelbond", имеется в наличии в FMC Corporation, Bio Products, Rockland, Maine 04841, USA.

________________

"Gelbond" является примером имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о поддержке этого продукта со стороны ISO или IDF.

A.3.2 Микропипетки вместимостью 0,004 см и 0,015 см.

А.3.3 Штампы размером диаметра 2,5 и 4,0 мм.

А.3.4 Пластмассовые подносы для окрашивания и промывания пластинок.

А.4 Реактивы

Используют реактивы только установленного аналитического качества и дистиллированную или деминерализованную воду, либо воду эквивалентной чистоты.

Примечание - Любое упоминание или информация о праве собственности в настоящем стандарте приведены для удобства пользователей настоящего стандарта и не являются подтверждением таких прав со стороны ISO или IDF.

А.4.1 Агароза, Indubiose А37 (IBF), тип HSA (Litex) или эквивалентный.

________________

Indubiose А37 - это пример имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о поддержке этого продукта со стороны ISO или IDF.

Примечание - Выбор агарозы не является решающим.

А.4.2 Хлорид натрия (NaCI).

А.4.3 Этанол, 95%.

А.4.4 Уксусная кислота, 100% (кристаллизованная).

А.4.5 Моноспецифические антитела и эталонные ферментные растворы

Моноспецифические антитела и эталонные ферментные растворы вместе с необходимыми инструкциями по применению можно получить в INRA (FR) или CHR. HANSEN (DK).

________________