ГОСТ ISO 15163-2014 Молоко и молочные продукты. Сычужный фермент из сычугов телят и ферментный препарат из сычугов крупного рогатого скота. Определение содержания химозина и говяжьего пепсина методом хроматографии

     7 Методика

7.1 Проверка

Перед проведением анализа проверяют ферментный препарат на отсутствие основных молокосвертывающих ферментов не животного происхождения, используя подходящий метод (см. приложение А). Проверку можно не проводить, если известно, что фермент содержит химозин и пепсин только животного происхождения.

7.2 Подготовка чистой колонки со смолой Fractogel

Готовую к использованию суспензию смолы Fractogel (4.1) после дегазации в вакууме разливают непосредственно из бутыли поставщика или, используя ультразвуковую водяную баню, заполняют ею колонку (5.3), установленную вертикально, с открытым выпуском, пока слой осажденной смолы Fractogel не достигнет высоты от 4,5 до 5,5 см. Во время проведения процедуры гелевая основа не должна быть сухой.

Закрывают выпускную трубку. Погружают конец впускного отверстия трубки перистальтического насоса в лабораторный стакан с буферным раствором I (4.12.1). Подсоединяют трубку адаптера к отводной трубке насоса. Регулируют скорость потока до (1,3±0,1) см/мин. Заполняют трубку адаптера буферным раствором I (4.12.1), не превышая общий внутренний объем трубок 1,5 см.

Закрывают колонку адаптером, как указано изготовителем колонки. Сжимают адаптером несколько миллиметров гелевой основы, чтобы ликвидировать свободное пространство над ней. Следует предупредить попадание пузырьков воздуха в колонку. Промывают колонку буферным раствором I (4.12.1) в течение 5 мин при скорости потока 1,3 см/мин.

7.3 Регенерация и уравновешивание смолы Fractogel в колонке

После подготовки новой колонки и после каждого цикла проводят регенерацию и приведение в равновесие смолы Fractogel (4.1) в колонке следующим способом.

Регенерируют смолу Fractogel в колонке, используя не менее 15 см буферного раствора IV (4.12.4), подавая его в течение 11-12 мин со скоростью потока 1,З см/мин. Колонку приводят в равновесие, используя не менее 40 см буферного раствора I (4.12.1), подавая его в течение 30 мин. После этого колонка готова для загрузки пробы для анализа.

Одну и ту же колонку можно использовать более 20 раз. После частого использования колонку очищают более тщательно, промывая ее раствором NaOH молярной концентрации 0,1 моль/дм в течение 10 мин, а затем водой в течение 10 мин. Затем проводят обычную процедуру регенерации и приведения в равновесие, как описано выше.

7.4 Хранение колонки со смолой Fractogel

Если колонка должна храниться более одной недели, ее промывают 15 см 20%-ного этанола (4.8) с помощью перистальтического насоса (5.1). Хранят колонку с плотно закрытыми впускными и выпускными каналами.

Колонку можно хранить несколько месяцев при комнатной температуре, стараясь избегать попадания прямого солнечного света.

7.5 Приготовление пробы для испытания

7.5.1 Общие требования

Жидкие пробы ферментных препаратов анализируют после подготовки по 7.5.2.

Пробу порошковых ферментных препаратов готовят следующим образом. Сухие пробы перед обессоливанием растворяют в подходящем количестве буферного раствора I (4.12.1) или с использованием буферного раствора с pH 5,5 (см. ISO 11815|IDF 157), чтобы получить раствор с общей молокосвертывающей активностью 200 ММЕ/см.

Перед обессоливанием определяют время свертывания растворенной пробы фермента в соответствии с ISO 11815|IDF 157. Проводят приблизительную оценку активности пробы, выраженную в ММЕ/см, устанавливая ее относительно эталона сычужного фермента, чтобы определить количество пробы на колонку (7.6.1 или 7.6.2).

Если результаты выражаются в миллиграммах на дм, при определении времени свертывания пробы сычужного фермента проводят два параллельных определения в соответствии с ISO 11815|IDF 157. В этом случае измеряют время свертывания одновременно или в быстрой последовательности до и после обессоливания.

Перед внесением пробы для анализа в колонку ее обессоливают путем диализа (7.5.2) или гель-фильтрации (7.5.3).

7.5.2 Обессоливание путем диализа

Диализную трубку (4.10) погружают в кипящую воду на 5 мин и промывают ее внутри и снаружи водой.

Диализ 5 см приготовленной анализируемой пробы (7.5) (активностью около 900 ММЕ) по отношению к 500 см буферного раствора I (4.12.1) проводят при температуре 4°С в течение от 5 до 20 ч. Диализную трубку очень крепко сжимают рукой, чтобы перекрыть ее в целях сокращения разбавления, которое происходит во время диализа. Во время диализа буферный раствор перемешивают магнитной мешалкой (5.4).

Если результаты выражаются в миллиграммах на дм, при определении времени свертывания пробы сычужного фермента, подвергнутой диализу, проводят два параллельных определения в соответствии с ISO 11815|IDF 157.

7.5.3 Обессоливание путем гель-фильтрации

Следуют инструкциям поставщика.

Колонку обессоливания (4.11) уравновешивают буферным раствором I (4.12.1). На колонку используют 3,3 см приготовленной пробы (7.5). Элюируют пробу буферным раствором I (4.12.1) объемом 4,0 см.

Для проб с низким содержанием химозина или пепсина иногда необходимо выполнить вышеуказанную процедуру дважды, чтобы получить достаточную активность фермента и иметь возможность адекватно определить низкое содержание компонента.