ГОСТ ISO 10273-2013 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения условно-патогенной бактерии Yersinia enterocolitica

     9 Порядок проведения испытания (см. приложение А)

9.1 Проба для испытания и исходная суспензия

9.1.1 См. соответствующую часть ISO 6887 или ISO 8261, или стандарта на конкретный продукт.

9.1.2 Для приготовления исходной суспензии помещают количество пробы для испытания (известной массы или объема) в известный объем PSB бульона (В.1), для достижения разведения 1/10 (по массе к объему или объему к объему). Гомогенизируют суспензию, используя перистальтический блендер в течение 2 мин.

9.1.3 Готовят вторую исходную суспензию по тому же принципу с ITC бульоном (В.2) так, чтобы получить соотношение навески к среде обогащения разведением 1/100 (масса к объему или объем к объему).

9.2 Обогащение

Инкубируют две исходные суспензии (9.1.2 и 9.1.3) следующим образом:

a) PSB среду при температуре от 22 °С до 25 °С от 42 до 72 ч с перемешиванием или в течение пяти дней без перемешивания.

b) ITC среду при температуре 25 °С в течение 48 ч.

9.3 Пересев и идентификация

9.3.1 После инкубации в среде обогащения (9.2) необходимо провести следующие операции:

9.3.2 Культуру, выросшую на PSB бульоне (9.2), пересевают посредством петли (6.11) на поверхность чашки Петри с CIN агаром (В.З) для получения хорошо изолированных колоний.

9.3.3 Используя стерильную пипетку (6.9), переносят 0,5 см культуры, выросшей на PSB бульоне (9.2), в 4,5 см раствора гидроксида калия (В.21) и перемешивают. После выдержки в течение (20±5) с инокулируют с помощью петли (6.11) поверхность чашки с CIN агаром (В.3) для получения хорошо изолированных колоний.

9.3.4 Культурой, выросшей на ITC бульоне (9.2), инокулируют с помощью петли (6.11) поверхность чашки с SSDC агаром (В.4) для получения хорошо изолированных колоний.

9.3.5 Переворачивают чашки вверх дном (9.3.2-9.3.4) и помещают их в термостат (6.2) при температуре 30 °С.

9.3.6 После инкубирования в течение 24 ч проверяют чашки с помощью увеличительного стекла (6.14), предпочтительно снабженного косым светом (6.13) с целью выявления присутствия колоний, типичных для Yersinia enterocolitica по следующим признакам:

a) на CIN агаре типичные колонии Yersinia enterocolitica мелкие (1 мм), ровные с красным центром и полупрозрачными краями, при проверке с помощью косого света (6.13) не имеют радужного перелива и тонко гранулированы;

b) на SSDC агаре типичные колонии Yersinia enterocolitica мелкие (1 мм) и серые с расплывчатыми краями, не обладают радужным переливом и тонко гранулированы при проверке под лучами косого света.

Примечание - Косой падающий свет помогает отличать типичные колонии Yersinia enterocolitica от похожих колоний бактерий рода Pseudomonas.

9.3.7 Если рост колоний медленный - окраска слабая или если нет типичных колоний - продолжается инкубация в чашках до 48 ч, и затем их снова просматривают.

9.4 Подтверждение

9.4.1 Для биохимической идентификации может быть использован коммерчески доступный и позволяющий проводить идентификацию Yersinia enterocolitica набор. Некоторые минимальные наборы для биохимической идентификации не идентифицируют точно такие виды бактерий рода Yersinia как Yersinia mollaretii и Yersinia bercovieri (прежние биовары Yersinia enterocolitica 3А и 3В) и Yersinia intermedia, которые идентифицируются как Yersinia enterocolitica. В этом случае должно быть проведено определение образования кислоты из муката. Требуется улучшение различительных тестов данных минимальных наборов для биохимической идентификации.

9.4.2 Отбор колоний для подтверждения

9.4.2.1 Для подтверждения берут с каждой чашки каждой селективной среды (см. 9.3.2-9.3.4) пять колоний, считающихся типичными или предположительно типичными. Переносят отобранные колонии на поверхность чашек с питательным агаром (В.5) таким образом, чтобы получить рост хорошо изолированных колоний.

Посевы инкубируют при температуре 30 °С в течение 24 ч.

Проверяют чашки на чистоту культуры. Если присутствуют смешанные культуры, то переносят каждую индивидуальную колонию снова на питательный агар и инкубируют, как указано выше.

Используют только чистые культуры для биохимических подтверждений и тестов на патогенность.

9.4.2.2 Плазмиды, которые определяют свойства патогенности бактерий рода Yersinia, могут быть спонтанно потеряны во время культивирования свыше 30 °С или при длительном культивировании при температуре ниже 30 °С.

Поэтому их сохраняют как замороженные культуры путем немедленного культивирования каждой чистой культуры в настое телячьего бульона (В.22).