5.1 Приготовление пробы для анализа
5.1.1 Общие положения
Специфические параметры анализируемого продукта (например, влажность) и его обработка могут влиять на количество и качество ДНК, экстрагируемой из анализируемого продукта. В связи с этим рабочие характеристики применяемого метода экстрагирования ДНК зависят от матрицы анализируемого продукта.
Необходимо принять соответствующие меры, чтобы гарантировать, что навеска пробы является представительной лабораторной пробой.
Навеска пробы должна быть достаточного размера (объема, массы) и содержать достаточное количество частиц для обеспечения представительности лабораторной пробы (например, 3000 частиц для предела обнаружения LOD 0,1%), возможности проведения дальнейшего статистического анализа и получения статистически обоснованного вывода по результатам анализа (см. ISO/DIS 21568).
Исходя из практических и технических соображений не рекомендуется, чтобы величина навески пробы превышала 2 г.
Любые ограничения, связанные с размером навески пробы, не позволяющие рассматривать ее как представительную пробу, должны быть учтены при интерпретации аналитических результатов и указаны в протоколе испытаний.
Методы экстрагирования ДНК, приведенные в приложении А, устанавливают размер навески пробы от 200 до 500 мг, что обычно является приемлемым для продукции с высоким содержанием ДНК (твердое и дробленое зерно, мука). Однако некоторые продукты содержат очень малое количество ДНК или деградировавшую ДНК, в связи с этим указанная навеска пробы не позволит экстрагировать достаточное для анализа количество ДНК. В таких случаях размер навески пробы может быть увеличен.
Экстрагирование ДНК должно выполняться не менее чем из двух навесок пробы одной и той же продукции.
Хранение стандартов, лабораторных проб и навесок проб должно соответствовать требованиям ISO 24276 и быть организовано таким образом, чтобы анализируемые биохимические параметры были сохранены (подробнее см. ISO/IEC 17025).
5.1.2 Пробы
Все операции по приготовлению лабораторных проб (например, измельчение, гомогенизация, деление, высушивание) должны выполняться в соответствии с методиками, описанными в ISO 24276. При выполнении всех необходимых операций должны быть приняты меры предосторожности для защиты лабораторной пробы от загрязнения или изменения ее состава.
Лабораторные пробы должны быть тщательно гомогенизированы перед их сокращением и отбором навесок пробы.
В случае жидких проб необходимо встряхивать сосуд с пробой для обеспечения гомогенизации продукта. В случае негомогенных продуктов типа неочищенных масел необходимо убедиться, что осадок и все нерастворимые составляющие полностью удалены со стенок сосуда.
В случае проб с твердыми матрицами, отличающимися затрудненным измельчением, лабораторная проба должна быть измельчена для уменьшения размера частиц и/или улучшения экстрагирования ДНК. В таких случаях особое внимание необходимо обратить на размер частиц. Навеска пробы, подвергаемая экстрагированию, должна содержать минимальное количество частиц, как установлено в ISO/DIS 21568. Необходимо, чтобы оборудование, предназначенное для дробления и измельчения пробы, было легко моющимся по всей рабочей поверхности и обеспечивало требуемое количество и размер частиц (гранулометрический состав) анализируемой пробы согласно ISO/DIS 21568.
Если какие-либо компоненты лабораторной пробы были удалены до проведения экстрагирования, то это должно быть указано в протоколе испытаний с описанием проведенных операций.
Для твердых или пастообразных готовых пищевых продуктов с высоким содержанием липидов достаточно трудно достичь требуемого размера частиц за один этап измельчения. В таких случаях допускается перед измельчением применять дополнительные процедуры, такие как удаление липидов гексаном после промежуточного измельчения, замораживание или сублимационная сушка.
Для улучшения измельчения пастообразных или вязких продуктов для некоторых матриц можно использовать одну из следующих обработок:
- нагрев до максимальной температуры 40°С;
- растворение в соответствующей жидкости, например воде;
- замораживание при температуре минус 20°С или ниже.
Гомогенизировать необходимо всю лабораторную пробу. Затем необходимо отобрать две навески пробы с учетом возможного проведения в дальнейшем процедур разбавления или концентрирования.
Во время проведения процедур размола и измельчения необходимо соблюдать меры, гарантирующие поддержание нагрева лабораторной пробы на минимальном уровне и не допускающие ее сильного нагревания, так как нагрев может отрицательно воздействовать на качество экстрагируемой ДНК.
По возможности необходимо избегать способов размола/измельчения, при которых возникает высокий риск перекрестного загрязнения (например, комбинированное использование жидкого азота и ступки, а также использование одной ступки для разных образцов). Одним из основных требований является необходимость изолирования любого методологического этапа, при проведении которого происходит образование пыли, от всех других аналитических этапов и процедур.
В случае присутствия в лабораторной пробе соли, сахарной пудры, специй и/или других веществ, которые могут потенциально оказывать влияние на экстрагирование или дальнейший аналитический метод, должны быть предприняты дополнительные соответствующие процедуры очистки в соответствии с используемым методом (см. приложение А).
Например, в случае проб сложного состава материал для исследования (матрица) (например, панировочный слой рыбных палочек) может быть отделен от остальной части продукта для экстрагирования ДНК.
5.2 Экстрагирование и очистка ДНК
5.2.1 Общие положения