ГОСТ ИСО 21571-2009 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Экстрагирование нуклеиновых кислот

Приложение А
(обязательное)

Методы экстрагирования ДНК

А.1 Получение применимой для ПЦР ДНК методами экстрагирования ДНК на основе фенола/хлороформа

А.1.1 Основной метод на основе фенола/хлороформа

А.1.1.1 Общие положения

Данный метод (см. [5]) применяется для экстрагирования ДНК из большой группы матриц (см. А.1.1.8).

Фенол обычно подходит для деструкции нуклеазы и денатурации белка.

При исследовании лиственной или зеленой массы растений (например, листьев цикория, высушенной люцерны) вместе с ДНК также могут соосаждаться многие ингибиторы ПЦР. По этой причине могут возникнуть трудности, связанные с повторяемостью получения ДНК, амплифицируемой в ПЦР.

С учетом агрессивных и опасных свойств фенола в качестве альтернативы целесообразно применять методы экстрагирования ДНК, основанные на ЦТАБ, и/или поливинилпирролидоне (ПВП), и/или на адсорбции диоксидом кремния.

А.1.1.2 Статус валидации

Этот метод широко применяется во всех областях биологии, агрономии и медицины на протяжении 40 лет, однако он никогда не подвергался оценке путем межлабораторных исследований для обнаружения ГМО в пищевых продуктах.

А.1.1.3 Принцип метода

Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия и этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) высокой концентрации) и последующее удаление загрязняющих примесей (например, липофильных молекул, полисахаридов и белков) и нуклеаз из водной фазы, содержащей ДНК, с помощью фенола и хлороформа. Заключительное осаждение этанолом концентрирует ДНК и удаляет соли и остаточный хлороформ. Критическим этапом метода является стадия лизиса [5].

А.1.1.4 Меры предосторожности

Работы с органическими реактивами необходимо выполнять в вытяжном шкафу.

А.1.1.5 Реактивы

А.1.1.5.1 Этанол, объем чистой фракции () = 96%.