3.1 Общие положения
Основной целью применения методов экстрагирования нуклеиновых кислот является обеспечение выделения нуклеиновых кислот, пригодных для последующего анализа (см. ISO 24276).
Примечание - Качество ДНК зависит от средней длины экстрагированных молекул ДНК, химической чистоты и структурной целостности одной нити и двойной спирали ДНК (например, внутри- и межцепочечные связи оснований ДНК, выпадение оснований в цепочке ДНК, перекрестные сшивки с высокомолекулярными спиртами, гемином и т.д.). Кроме того, такие структурные изменения часто являются специфичными для определенной последовательности ДНК и поэтому не распределены по геному случайным образом (см. [1]-[4]).
Пользователям настоящего стандарта необходимо иметь в виду, что некоторые методы (например, методы на основе диоксида кремния) могут быть запатентованы.
3.2 Экстрагирование ДНК
Основной принцип экстрагирования ДНК заключается в выделении ДНК, присутствующей в матрице пробы, а затем одновременной или последующей очистке ДНК от ингибиторов ПЦР.
Методы экстрагирования и очистки ДНК изложены в приложении А. Выбор метода основывается на опыте пользователя с учетом области применения и примеров матриц, которые указаны в каждом методе.
Альтернативные методы могут применяться при условии, что метод был проверен на соответствующей матрице, подлежащей исследованию.
3.3 Количественная оценка содержания ДНК
Количественная оценка экстрагированной ДНК может потребоваться для последующего анализа ПЦР.
Такая оценка может выполняться либо физическими (например, измерением поглощения на специфической длине волны), физико-химическими (например, применением интеркалирующих или связующих агентов, обладающих флюоресцентными свойствами), ферментативными (например, биолюминесцентным обнаружением) методами, либо путем количественной ПЦР. Последний метод применяется для составных и сложных матриц, проб с низким содержанием ДНК или проб, в которых ДНК подверглась деградации.
Существует несколько методов, применяемых для определения количества ДНК, присутствующей в растворе. Эти методы изложены в приложении В.
Выбор наиболее подходящего метода осуществляется пользователем в зависимости от количества и качества ДНК, подлежащей количественному определению, а также от матрицы, из которой была экстрагирована ДНК.
Альтернативные методы могут применяться при условии, что метод был проверен на соответствующей матрице.