ГОСТ ИСО 21570-2009 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте

     С.1 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания сои линии GTS 40-3-2 с использованием ПЦР в реальном времени (метод 1)

С.1.1 Введение

В настоящем приложении описан метод специфической амплификации и обнаружения таксон-специфического гена сои (ген лектина, le1) и ДНК, происходящей из специфической генной конструкции, присутствующей в ГМ-сое линии GTS 40-3-2. Метод пригоден для количественного определения ДНК, происходящей из ГМ-сои линии GTS 40-3-2, в соевых ингредиентах, содержащих ГМ-сою линии GTS 40-3-2 (Roundup Ready®).

_______________

Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

Ограничения см. в С.1.7.

С.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров

С.1.2.1 Общие положения

   Метод был оптимизирован для СЭМ (СЭМ IRMM-410) [18], состоящих из высушенной муки соевых бобов, включающих смеси сои GTS 40-3-2 и обычной сои.

_______________

Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

Воспроизводимость описанных методов была проверена в ходе межлабораторных испытаний с использованием неизвестных образцов (образцы, помеченные как SА-SЕ, см. в таблице С.1), состоящих из смеси эталонных материалов вышеперечисленного типа [19]. Кроме того, были протестированы доступные пищевые продукты [20].

Число копий каждой из целевых последовательностей на геном подробно оценено не было [21], [22].

Метод был опубликован в [23].

С.1.2.2 Межлабораторные испытания

Пять неизвестных образцов, содержащие от 0,7% до 3% (по массе) высушенной соевой муки из сои линии GTS 40-3-2, были проанализированы одиннадцатью участниками.

Метод, специфичный для обнаружения конструкции GTS 40-3-2, дал относительное стандартное отклонение воспроизводимости в диапазоне от 16% до 28% (см. таблицу С.1). В ходе начальных экспериментов межлабораторных испытаний было определено, что 1%-ный соевый СЭМ не соответствовал заявленной величине.

Исследования показали, что различавшиеся эталонные материалы были изготовлены разными способами в разное время, что и привело к разному уровню деградации ДНК. Участники межлабораторных испытаний были поставлены в известность о необходимости в ходе этого совместного испытания применять 2%-ный СЭМ и разбавлять его для получения раствора 1%-ной эталонной ДНК для использования при количественном определении.

Для экстракции ДНК использовалась процедура, приведенная в [23]. 200 нг материала образца было лизировано в 1 мл буфера [гуанидингидрохлорид//протеиназа К (0,5 моль/л//0,8 мг/мл)] при 56°С в течение 3 ч. После стадии обработки РНКазой 500 мкл очищенного экстракта смешивалось с 1 мл силикагелевой смолы Wizard® и смола со связанной ДНК была пропущена через колонку с фильтром Wizard®. После промывания изопропанолом ДНК элюировали из силикагелевой смолы в 10 ммоль/л Трис-буфером рН 9,0 при 70°С. Концентрацию ДНК определяли измерением оптической плотности при 260 нм и приводили к уровню 20 мкг/мл. Для последующего ПЦР-анализа 200 нг ДНК из каждого образца было проанализировано в двух независимых реакциях.

_______________

Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

Каждый образец анализировался дважды.

Поскольку образцы, помеченные SA-SE, представляли собой смеси этих различных эталонов, результаты, полученные с помощью этих образцов, не могут быть использованы для оценки истинности предложенного метода ПЦР в реальном времени. Однако эти результаты могут быть использованы для оценки точности этих методов, в силу чего описанные обстоятельства отражают наихудший сценарий, ведущий к недооценке точности прикладного метода ПЦР в реальном времени [19].

Исключение лабораторий основано на использовании приборов ПЦР в реальном времени и на статистическом расчете выбросов. Метод был разработан для блочных термоциклеров. Поэтому две лаборатории, использовавшие системы LightCycler® (Roche Diagnostics), были исключены еще до расчета выбросов. Исключение определенных приборов для ПЦР обусловлено тем, что прикладной метод нуждается в тщательной адаптации и оптимизации в том случае, если он проводится на приборе для ПЦР в реальном времени, отличном от того, который поименован в методе. Оставшиеся лаборатории были, кроме того, проверены на выбросы по Граббсу [24]. Однако не было обнаружено ни одного выброса. Подробности межлабораторных испытаний приведены в таблице С.1.

_______________

Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

Таблица С.1 - Данные валидации 35S-промотор-специфического обнаружения ГМО