ГОСТ ИСО 21570-2009 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте
А.1 Метод специфического целевого таксона для определения абсолютного количественного содержания ДНК гена adh1* из кукурузы с использованием метода ПЦР в реальном времени
_______________
* В оригинале слово "adh" в наименовании пункта А.1 выделено курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.
А.1.1 Введение
В настоящем приложении описан метод специфической амплификации и количественного определения (вспомогательного) гена adh1 (кодирующего алкогольдегидрогеназу 1) из кукурузы (Zea mays) для определения содержания ДНК-кукурузы или для тестирования присутствия/отсутствия в растворах ДНК, экстрагированной из продуктов, содержащих ДНК-кукурузу, например из пищевых продуктов, обнаруженных количеств ингибиторов ПЦР.
Ограничения см. в А.1.8.
А.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров
А.1.2.1 Общие положения
Метод был оптимизирован для ДНК, экстрагированной из чистых размолотых кукурузных зерен, листьев кукурузы и СЭМ (серий IRMM-411, IRMM-412, IRMM-413 [10]) [11].
Воспроизводимость описанного метода была проверена с помощью межлабораторных испытаний с использованием неизвестных образцов (U1-U6), состоящих из ДНК-кукурузы дикого типа с различным числом копий соответствующей целевой последовательности (см. А.1.2.2), а также других межлабораторных испытаний в комбинации с методами специфического события ГМ-кукурузы, например Bt11 (см. D.1).
Число копий целевой последовательности на гаплоидный геном должно быть равно 1 [11].
Должна быть установлена аллельная стабильность целевой последовательности [11].
А.1.2.2 Межлабораторные испытания
Подтверждение достоверности (валидация) метода было проведено в ходе межлабораторных испытаний, организованных объединенным исследовательским центром Еврокомиссии (EC-JRC) и институтом защиты здоровья и потребителей (IHCP) в соответствии с международным протоколом гармонизации [12].
Для построения калибровочной кривой для определения абсолютного количества гаплоидных геномов кукурузы в неизвестных образцах были использованы шесть образцов (S1-S6) ДНК-кукурузы дикого типа (экстрагированной из материала листьев [13]), содержащей известное абсолютное число копий (183486, 61162, 20387, 6796, 2265 и 755) гаплоидных геномов кукурузы. Абсолютное число копий в известных образцах было определено путем деления массы ДНК (определенной методом флуориметрического количественного определения двухцепочечной ДНК фирмы PicoGreen, Molecular Probes, Cat. Number P-7589) на справочное среднее значение 1С для геномов кукурузы (2,725 пг) [14].
Шесть образцов (U1-U6) ДНК-кукурузы дикого типа (экстрагированной из материала листьев [13]) были использованы в качестве неизвестных образцов. Ожидаемое число копий в неизвестных образцах было определено тем же методом, что и в известных образцах.
Результаты подтверждения достоверности метода, полученные в ходе межлабораторных испытаний, суммированы в таблице А.1.
Валидация метода была также проведена в комбинации с методами специфического события для нескольких образцов ГМ-кукурузы, например для сладкой кукурузы Bt11. Подробности комбинированных испытаний (относительного количественного определения) см. в [15] и [16], а также в D.1.
Таблица А.1 - Данные валидации
Образец | ||||||
U1 | U2 | U3 | U4 | U5 | U6 | |
Количество участвовавших лабораторий, шт. | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Количество лабораторий, имевших возвратные результаты, шт. | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
Количество исключенных лабораторий, шт. | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Количество лабораторий, оставшихся после исключения, шт. | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 |
Количество образцов на лабораторию, шт. | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
Число выбросов по тесту Кохрана | 1 | 1 | 1 | 1 | - | - |
Число выбросов по тесту Граббса | - | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Количество принятых образцов, шт. | 35 | 34 | 34 | 34 | 35 | 35 |
Значение ожидаемого числа копий | 7339 | 18349 | 36697 | 55046 | 91743 | 146788 |
Среднее значение числа копий | 9985 | 23885 | 46918 | 75161 | 100541 | 122080 |
Отклонение от истинного значения, % | 36,1 | 30,2 | 27,9 | 36,5 | 9,6 | -16,8 |
Стандартное отклонение повторяемости | 1318,59 | 1463,60 | 5796,58 | 4539,57 | 11306,89 | 14843,41 |
Относительное стандартное отклонение повторяемости, % | 13,21 | 6,13 | 12,35 | 6,04 | 11,25 | 12,16 |
Стандартное отклонение воспроизводимости | 2013,12 | 2083,57 | 6145,39 | 6806,85 | 14592,04 | 17777,70 |
Относительное стандартное отклонение воспроизводимости, % | 20,16 | 8,72 | 13,10 | 9,06 | 14,51 | 14,56 |
| ||||||
А.1.2.3. Молекулярная специфичность
А.1.2.3.1 Общие положения
Метод был разработан для использования в качестве целевой части последовательности, описанной в EMBL/GenBank/DDBJ, регистрационный номер Х04050. Эта последовательность является уникальной для Zea mays (кукуруза/маис) и Zea mays subsp. diploperennis (теосинте мексиканского) [11].
_______________
Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.
А.1.2.3.2 Теоретическая специфичность
Теоретическая специфичность праймеров и зондов оценена путем поиска в базах данных EMBL/GenBank/DDBJ с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN
на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ [9 октября 2003 г.]. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемыми целевыми последовательностями.
_______________