Методы скрининга
В.1 Метод скрининга для обнаружения ДНК генетически модифицированных растений (промотор 35S вируса мозаики цветной капусты)
В.1.1 Общие положения
Этот метод предназначен для обнаружения различного количества копий последовательности ДНК промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Так как промотор 35S присутствует во многих генетически модифицированных растениях, этот метод может быть использован для скрининга наличия ДНК из генетически модифицированного растения [22], [23].
В.1.2 Метрологическая аттестация и критерии выполнения
В.1.2.1 Совместные сличительные испытания
Этот метод был метрологически аттестован в нескольких совместных сличительных испытаниях с использованием различных материалов пищевых продуктов (как сырье, так и переработанные продукты) [24], [25].
Этот метод был метрологически аттестован в совместном сличительном испытании [24], проведенном под руководством рабочей группы "Разработка методов идентификации пищевой продукции, произведенной с использованием технологий генной инженерии" Немецкого федерального института защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV). Количество участников, а также количество образцов устанавливали в соответствии с критериями ISO 5725-2. Для выделения ДНК использовали метод ЦТАБ, описанный в ISO 21571:2005, А.3 (однако вес анализируемой части образца составлял 100 мг).
Данные совместных сличительных испытаний приводятся в таблице В.1.
Таблица В.1 - Результаты совместных сличительных испытаний
Год проведения испытаний | 1999 |
Количество лабораторий | 27 |
Количество лабораторий, представивших результаты | 23 |
Количество образцов на лабораторию | 5 |
Количество принятых результатов | 115 |
Количество образцов, содержащих сою линии GTS 40-3-2 | 59 |
Количество образцов, содержащих немодифицированную сою | 56 |
Ложноположительные результаты | 0 (0%) |
Ложноотрицательные результаты | 0 (0%) |
В.1.2.2 Молекулярная специфичность
В.1.2.2.1 Общие положения
Это приложение удовлетворяет требованиям, изложенным в разделе 7.
Метод был разработан для целевой последовательности, описанной, например, в базе данных GenBank®, доступ N V00141.
Список генетически модифицированных растений, содержащих промотор 35S CaMV, приводится в приложении к ссылке [24].
Не исключается возможность получения ложноположительных результатов из-за того, что амплифицируемая последовательность получена из вируса мозаики цветной капусты, поражающего цветную капусту, а также другие растения семейств Brassicaceae (Cruciferae), а также Resedaceae и Solanaceае [26], [27].
В связи с этим следует с особенной тщательностью рассматривать положительные результаты, полученные при анализе образцов из растений семейств Brassicaceae, Resedaceae и Solanaceae.
Положительные результаты могут означать наличие продукта, полученного из генетически модифицированных растений, однако не могут быть интерпретированы как доказательство наличия генетически модифицированного продукта без дополнительного подтверждения.
Для того чтобы различить инфицирование вирусом и генетическую модификацию, можно использовать методы обнаружения вируса мозаики цветной капусты [6].
В.1.2.2.2 Теоретическая часть
Поиск по базам данных (NCBI BlastN®, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), по состоянию на 28 сентября 2001 г.) не обнаружил гомологии целевой последовательности ДНК с немодифицированными сельскохозяйственными растениями. Однако оба праймера совпадали с одним доступом базы данных, не относящимся ни к вирусу мозаики цветной капусты, ни к рекомбинантным векторам или патентам: S70105 ср (белок оболочки) вируса мозаики огурцов. Кроме того, праймеры соответствовали более чем 100 позициям базы данных, относящимся к вирусу мозаики цветной капусты и рекомбинантным векторам и патентам.
В.1.2.2.3 Экспериментальная часть
При проведении ПЦР с использованием ДНК, выделенной из немодифицированных сельскохозяйственных растений в отсутствие вируса мозаики цветной капусты, не наблюдали амплификации [22], [24], [25], [28].
Успешная амплификация была обнаружена при проведении ПЦР на ДНК, выделенной из различных генетически модифицированных растений, например GTS-40-3-2 (соевые бобы RoundUp Ready®), линий кукурузы Event 176 (Bt 176), Bt 11, MON 810, MON 809, а также томатов с замедленным созреванием (Zeneca) [22], [24], [25], [28].
Количество копий последовательности ДНК может варьироваться.