ГОСТ ИСО 21569-2009 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Методы качественного обнаружения на основе анализа нуклеиновых кислот (с Изменением N 1)
7 Процедура анализа
7.1 Качество, целостность и амплифицируемость выделенной нуклеиновой кислоты
Раствор нуклеиновой кислоты должен быть достаточно чистым для последующего анализа [3]. Качество и количество выделенной с помощью заданного метода из определенного материала образца нуклеиновой кислоты должны быть повторяемы и воспроизводимы.
Примечание - Качество, целостность и количество образца ДНК влияет на выход ПЦР и, следовательно, на получаемые результаты анализа. Предел обнаружения конкретного метода может, таким образом, зависеть от того, был ли анализируемый материал обработан или очищен, а также от степени деградации (разрушения) ДНК в нем.
Нуклеиновые кислоты, используемые в ПЦР, не должны содержать ингибиторы ПЦР [4]. Необходимо использовать контроли ингибирования ПЦР, описанные в ISO 24276.
7.2 Критерии выполнения анализа
Общие критерии выполнения анализа описаны в ISO 24276.
Значения характеристик выполнения анализа приводятся для каждого метода и указаны в приложениях А-D; при этом следует учитывать размер генома, см. [5].
Для каждой пары праймеров и/или системы следует оптимизировать условия реакции, особенно концентрацию 
и программу работы амплификатора. При использовании какой-либо системы праймеров в первый раз необходимо предварительно доказать, что условия цикла, выбранные для конкретного изучаемого материала образца, позволяют избежать образования нежелательных конкурирующих продуктов реакции, которые в противном случае снизят чувствительность обнаружения в ПЦР.
В оптимальной реакции требуется менее 40 циклов для амплификации 10 и более целевых молекул и получения продукта, который может быть легко обнаружен стандартными методами. По мере увеличения числа циклов возможно накопление неспецифических продуктов реакции. Оптимизированная ПЦР должна позволять получить за 40 циклов из чистого образца стандартного состава, в котором содержатся 100 копий матрицы ДНК, достаточное для обнаружения количество копий продукта ПЦР. Следует строго придерживаться заданных количества циклов, профиля кривой "температура - время" для каждой системы праймеров и реакционной смеси, учитывая используемое оборудование.
В целом следует максимально возможно увеличивать специфичность реакции (например, используя ПЦР с "горячим стартом"). ПЦР с "горячим стартом" рекомендуется как средство снижения побочных реакций (например, амплификация нецелевых последовательностей фоновой ДНК (ошибочная посадка праймеров) или олигомеризация праймеров) и, таким образом, увеличения специфичности метода.
Значения, полученные в ходе метрологической аттестации, могут быть не применимы к диапазонам концентраций анализируемого вещества и материалам образцов, отличающихся от перечисленных в соответствующих приложениях.
7.3 Аспекты подбора параметров ПЦР
7.3.1 Общие положения
Так как выполнение каждой индивидуальной ПЦР должно быть сопоставимо с другими специфическими ПЦР, следует учитывать приведенные далее аспекты подбора параметров ПЦР.
7.3.2 Размер ПЦР-продуктов
Размер целевой последовательности следует выбирать таким образом, чтобы он попадал в диапазон молекулярных масс, имеющихся в выделенной из анализируемого образца ДНК.
Пример - Для сильно деградировавшей ДНК из продуктов, прошедших термическую обработку, оптимальный размер ПЦР-продукта должен быть в диапазоне от 60 до 150 пар нуклеотидов (п.н.). Для сырья можно использовать более широкий диапазон, например вполне допустимо значение 250 п.н.
Однако, если в результате предварительно проведенных экспериментальных исследований по оценке соответствия наборов праймеров получены ПЦР-продукты различного размера, эти праймеры могут быть использованы для анализа образцов, материал которых был аттестован в таких исследованиях.
7.3.3 Праймеры
7.3.3.1 Общие положения
Информация о последовательности праймеров приводится в приложениях A-D.
7.3.3.2 Подбор праймеров
Последовательности праймеров должны по возможности иметь следующие характеристики:
- длина каждого праймера - от 18 до 30 нуклеотидов;
- оптимальная температура отжига - 60°С (должна быть установлена экспериментальным путем), т.е. расчетная температура плавления должна быть
65°С;
- по возможности соотношение GC:AT=50:50 или как можно ближе к этому соотношению;
- высокая внутренняя стабильность (не допускается концентрация нуклеотидов G и С в коротких сегментах праймеров);
- минимальная 3'-концевая комплементарность для предотвращения образования димеров праймеров;