ГОСТ EN 15891-2013 Продукты пищевые. Определение дезоксиниваленола в продовольственном зерне, продуктах его переработки и продуктах на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста. Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта и спектрофотометрического детектирования в ультрафиолетовой области спектра

     6 Процедура проведения испытания

6.1 Общие положения

Метод прошел валидацию путем трех межлабораторных испытаний, проведенных в разных лабораториях в разное время. По этой причине процедуры экстракции и иммуноаффинной очистки экстракта для зерна пшеницы, кукурузы, рисовой и овсяной муки, поленты и концентратов типа сухого завтрака на пшеничной основе, описанные в 6.2 и 6.4, и для продуктов для питания грудных детей и детей раннего возраста на зерновой основе, описанные в 6.3 и 6.5, различаются. Процедура проведения испытания, описанная в настоящем разделе, аналогична процедуре, использованной при проведении межлабораторных испытаний.

6.2 Процедура экстракции при испытании зерна пшеницы, кукурузы, рисовой и овсяной муки, поленты и концентратов типа сухого завтрака на пшеничной основе

25 г пробы для анализа , взвешенной с точностью до 0,1 г, помещают в центрифужную пробирку по 5.8. В пробирку добавляют 5 г полиэтиленгликоля по 4.12 и 200 см воды (или другой объем воды, предписанный производителем иммуноаффинной колонки). Содержимое пробирки гомогенизируют при большой скорости в течение 3 мин с использованием гомогенизатора по 5.4.

В качестве альтернативы допускается использовать следующие способы экстракции, обеспечивающие аналогичные результаты. Пробу для анализа помещают в коническую колбу, добавляют экстрагент, после чего содержимое колбы встряхивают с использованием встряхивателя кистевого типа в течение 2 ч, либо перемешивают с помощью магнитной мешалки по 5.5 в течение 30 мин при средней скорости. В обоих случаях пробу для анализа и экстрагент предварительно тщательно перемешивают вручную.

По окончании экстракции гомогенизированную пробу центрифугируют в течение 15 мин при центробежном ускорении 2500 g. Центрифугат фильтруют через стекловолоконный фильтр по 5.10.

Примечание - В ходе межлабораторных испытаний установлено, что для некоторых матриц, в частности, кукурузы, при экстракции с использованием магнитной мешалки последующее центрифугирование не обязательно.

6.3 Процедура экстракции при испытании продуктов на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста

25 г пробы для анализа , взвешенной с точностью до 0,1 г, помещают в коническую колбу вместимостью 250 или 500 см. В колбу добавляют 200 см воды , после чего колбу укупоривают и встряхивают с использованием лабораторного встряхивателя по 5.5 в течение 1 ч. По окончании встряхивания осадку дают отстояться, после чего порцию надосадочной жидкости объемом 50 см переносят в центрифужную пробирку по 5.8 и центрифугируют в течение 15 мин при центробежном ускорении 2500 g. Центрифугат фильтруют через воронку с фильтром по 5.9 в коническую колбу вместимостью 250 или 500 см.

6.4 Очистка экстракта на колонке с иммуноаффинным сорбентом при испытании зерна пшеницы, кукурузы, рисовой и овсяной муки, поленты и концентратов типа сухого завтрака на пшеничной основе

Иммуноаффинную колонку подготавливают к использованию в соответствии с инструкциями производителя.

Аликвоту водного экстракта, полученного по 6.2, объемом 2,0 см вносят в резервуар (5.12) иммуноаффинной колонки по 4.18 и полностью пропускают через колонку со скоростью около одной капли в секунду. Далее колонку промывают, пропуская через нее 5,0 см воды или фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.10. Затем из колонки удаляют жидкость путем продувания через нее воздуха. Далее в резервуар колонки вносят пипеткой 2,0 см ацетонитрила по 4.11 или метанола по 4.13, в соответствии с инструкциями производителя. Растворителю дают медленно впитаться в колонку, после чего выход элюата перекрывают. Колонку выдерживают в таком состоянии в течение 1 мин, после чего открывают выход элюата и элюируют дезоксиниваленол со скоростью около одной капли в секунду, собирая элюат во флакон вместимостью 4 см или диагностическую пробирку по 5.13. По окончании выхода растворителя из колонки через нее аккуратно продувают воздух для обеспечения полного, вплоть до последней капли, выведения и сбора элюата.

Примечание - При проведении очистки экстракта следует обращать внимание, чтобы сорбционная емкость колонки не была превышена.

6.5 Очистка экстракта на колонке с иммуноаффинным сорбентом при испытании продуктов на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста

Иммуноаффинную колонку подготавливают к использованию в соответствии с инструкциями производителя.

Аликвоту водного экстракта, полученного по 6.3, объемом 10,0 см вносят в резервуар (5.12) иммуноаффинной колонки по 4.18 и дают жидкости медленно протечь через колонку со скоростью около одной капли в секунду. После полного прохождения экстракта через колонку пропускают 5,0 см воды или фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.10. Затем из колонки удаляют жидкость путем продувания через нее азота в течение около 5 с. На данной стадии очистки экстракта элюент отбрасывают. Далее в резервуар колонки вносят 0,5 см метанола по 4.13 и дают растворителю впитаться в колонку. Колонку выдерживают в течение 1 мин, не допуская вытекания из нее растворителя, после чего начинают элюирование, собирая элюат во флакон по 5.13 вместимостью от 2,0 до 2,5 см. Затем в резервуар колонки вносят новую порцию метанола объемом 1,0 см и продолжают элюирование. Для обеспечения полного, вплоть до последней капли, выведения и сбора элюата через колонку аккуратно продувают воздух.

Примечание - Для иммуноаффинных колонок разных производителей методы ввода экстракта, промывания колонки и элюирования аналита несколько различаются. Поэтому следует в точности соблюдать прилагаемую к колонке инструкцию по ее использованию. В общем виде процедура приготовления раствора пробы при определении дезоксиниваленола включает в себя операции получения водного экстракта, его центрифугирования и фильтрации, ввода аликвоты экстракта в предварительно промытую колонку с применением давления, промывания колонки дистиллированной водой или фосфатно-хлоридным буферным раствором и элюирования дезоксиниваленола метанолом или ацетонитрилом. Следует обращать внимание, чтобы предельно допустимый объем вводимого в колонку экстракта или сорбционная емкость колонки не были превышены.

6.6 Приготовление раствора пробы для хроматографического анализа

Флакон с элюатом помещают в нагреватель или термостатируемую водяную баню по 5.14 и выпаривают растворитель в токе азота при температуре не более 50 °С. Сухой остаток перерастворяют при комнатной температуре в 0,5 см дилюента по 4.15 или подвижной фазы по 4.16. Для обеспечения полного растворения остатка содержимое флакона тщательно перемешивают в течение не менее 30 с, например с использованием миксера типа Вортекс по 5.6.

Примечания:

1 При необходимости перед хроматографическим анализом раствор пробы фильтруют. При этом для проверки отсутствия потерь аналита при фильтрации следует провести предварительный контрольный опыт с раствором пробы с добавлением стандартного раствора дезоксиниваленола.

2 Допускается хранить сухой остаток после выпаривания элюата в течение недели при температуре (4±2) °С в отсутствии доступа света.

6.7 Приготовление контрольной пробы с добавкой дезоксиниваленола

Для определения полноты обнаружения аналита готовят контрольную пробу с добавлением раствора дезоксиниваленола по 4.23. В пробу вносят такое количество дезоксиниваленола, чтобы его массовая концентрация в растворе пробы для хроматографического анализа находилась в пределах диапазона градуировки, предпочтительно, в его середине. Раствор дезоксиниваленола добавляют к анализируемой порции пробы, заведомо не содержащей дезоксиниваленола. Приготовленную таким образом пробу для анализа выдерживают в течение 30 мин до добавления экстрагента.