7.1 Подготовка пробы
Пробу измельчают до частиц, проходящих через сито размером ячеек 1 мм. Измельченную пробу перемешивают до гомогенного состояния.
7.2 Экстракция
Пробу для анализа массой 20 г, измеренной с точностью до 0,1 г, помещают в центрифужную пробирку по 5.3. В пробирку добавляют 50 см
экстрагента по 4.14. Пробирку укупоривают, после чего встряхивают в течение 20 мин с использованием орбитального встряхивателя по 5.2. По окончании встряхивания содержимое пробирки центрифугируют в течение 10 мин при центробежном ускорении 2500 g. Центрифугат фильтруют через бумажный фильтр по 5.5, при этом следят, чтобы осадок не попадал на фильтр. Осадок в центрифужной пробирке подвергают повторной экстракции, для чего в пробирку вносят новую порцию экстрагента объемом 50 см. Содержимое пробирки снова встряхивают в течение 20 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при центробежном ускорении 2500 g. Центрифугат фильтруют через бумажный фильтр, фильтрованные экстракты объединяют.
Пипеткой отбирают аликвоту объединенного экстракта объемом 10,0 см и помещают ее в колбу вместимостью 100 см. В колбу добавляют 40 см фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.16, содержимое колбы тщательно перемешивают и фильтруют через стекловолоконный фильтр по 5.6. Для дальнейшей очистки на иммуноаффинной колонке отбирают аликвоту фильтрата объемом 10 см, эквивалентную 0,4 г пробы.
7.3 Очистка экстракта на колонке с иммуноаффинным сорбентом
Из входного отверстия колонки удаляют пробку и соединяют колонку с резервуаром для элюента по 5.7. Далее из выходного отверстия колонки удаляют пробку и присоединяют колонку к вакуумному манифолду по 5.11. В резервуар колонки пипеткой вносят аликвоту экстракта объемом 10 см и пропускают ее через колонку со скоростью одна - две капли в секунду, элюат отбрасывают. Далее колонку промывают, пропуская через нее 10,0 см фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.16 со скоростью одна - две капли в секунду до тех пор, пока колонка не заполнится воздухом, промывной элюат отбрасывают. Фумонизины элюируют порцией метанола по 4.2 объемом 1,5 см со скоростью не более одной капли в секунду, элюат собирают во флакон вместимостью 4 см. Собранный элюат выпаривают досуха с помощью устройства по 5.13 в токе азота при температуре не более 60 °С. До проведения дериватизации и хроматографического анализа сухой остаток хранят при температуре около 4 °С.
7.4 Дериватизация
7.4.1 Дериватизация фумонизинов в градуировочных растворах
Дериватизацию проводят непосредственно перед хроматографическим анализом градуировочных растворов. На дно пробирки небольшой вместимости помещают 50 мм градуировочного раствора смеси фумонизинов B
и В
и 50 мм реактива для дериватизации по 4.19. Содержимое пробирки интенсивно перемешивают в течение 30 с с помощью миксера типа Вортекс по 5.12, после чего полученный раствор анализируют методом ВЭЖХ по 7.5.2. При этом для всех градуировочных растворов соблюдают равные промежутки времени с момента внесения реактива для дериватизации до момента хроматографического анализа, которые, однако, не должны превышать 3 мин. Допускается проводить дериватизацию с использованием автоматизированной системы. Массовая концентрация фумонизинов в градуировочных растворах после дериватизации указана в таблице 2.
Таблица 2 - Массовая концентрация фумонизинов в градуировочных растворах после дериватизации
| | |
Градуировочный раствор | Массовая концентрация фумонизина B в градуировочном растворе, нг/мм
| Массовая концентрация фумонизина В в градуировочном растворе, нг/мм |
1
| 0,050 | 0,025 |
2
| 0,125 | 0,063 |
3
| 0,500 | 0,250 |
4
| 1,000 | 0,500 |
7.4.2 Приготовление раствора пробы для хроматографического анализа
Дериватизацию фумонизинов в растворе пробы проводят непосредственно перед его хроматографическим анализом. Сухой остаток, полученный после очистки экстракта по 7.3, растворяют в 200 мм водно-ацетонитрильной смеси по 4.15. Аликвоту полученного раствора объемом 50 мм помещают непосредственно на дно пробирки небольшой вместимости. В пробирку добавляют 50 мм реактива для дериватизации по 4.19. Содержимое пробирки интенсивно перемешивают с помощью миксера типа Вортекс по 5.12, после чего полученный раствор анализируют с помощью ВЭЖХ по 7.5.3. При этом для серии растворов проб соблюдают равные промежутки времени с момента внесения реактива для дериватизации до момента хроматографического анализа, которые, однако, не должны превышать 3 мин.
7.5 Анализ с помощью ВЭЖХ
7.5.1 Условия хроматографического анализа
Приведенные ниже параметры обеспечивают удовлетворительное качество хроматографического анализа (см. рисунок А.1, приложение А) при использовании аналитической колонки по 5.15.3 внутренним диаметром 4,6 мм, длиной 150 мм и диаметром частиц сорбента 5 мкм, а также подвижной фазы по 4.18.
Скорость подачи подвижной фазы - 1,0 см/мин.
Параметры работы флуориметрического детектора: длина волны возбуждения 335 нм, длина волны эмиссии 440 нм.
Объем инжекции анализируемых растворов - 20 мм.
7.5.2 Анализ градуировочных растворов
Градуировку по фумонизинам B и В осуществляют ежедневно перед анализом растворов проб или при изменении условий хроматографического анализа. Для этого проводят хроматографический анализ приготовленных по 7.4.1 градуировочных растворов при объеме инжекции 20 мм. Для всех градуировочных растворов соблюдают равные промежутки времени с момента внесения реактива для дериватизации по 4.19 до момента хроматографического анализа, не превышающие 3 мин. Коэффициент вариации площади пиков фумонизинов B и В, рассчитанный по результатам 10 повторных анализов градуировочного раствора смеси фумонизинов N 3 по таблице 1, не должен превышать 5%.
7.5.3 Анализ растворов проб
Проводят хроматографический анализ растворов проб по 7.4.2 при объеме инжекции 20 мм, соответствующем 0,02 г пробы. При анализе серии растворов проб соблюдают равные промежутки времени с момента внесения реактива для дериватизации по 4.19 до момента хроматографического анализа, не превышающие 3 мин.
7.5.4 Идентификация пиков
Пики фумонизинов B и В на хроматограмме раствора анализируемой пробы идентифицируют по совпадению их времени удерживания со временем удерживания пиков фумонизинов B и В на хроматограмме градуировочного раствора. При возникновении сомнений в правильности идентификации пики фумонизинов на хроматограмме раствора пробы идентифицируют путем ее сопоставления с хроматограммой раствора пробы с добавлением градуировочного раствора фумонизинов.
7.5.5 Количественное определение
