ГОСТ Р 55569-2013 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение протеиногенных аминокислот методом капиллярного электрофореза

     7 Проведение испытаний

7.1 Схемы испытаний

Испытания проводят в соответствии с выбранной схемой:

- схема испытаний 1 предназначена для определения аланина, аргинина, лизина, валина, гистидина, глицина, тирозина, лейцина и изолейцина (в сумме), метионина, пролина, серина, треонина, фенилаланина;

- схема испытаний 2 предназначена для определения аспарагина, глутамина, цистина.

Примечания

1 В процессе подготовки проб аспарагин и глутамин количественно гидролизуются до аспарагиновой и глутаминовой кислот соответственно, данные по содержанию аспарагиновой и глутаминовой кислот представляют собой суммарное содержание этих кислот и соответствующих амидов.

2 Цистин (Cys-Cys) является устойчивой формой протеиногенной аминокислоты цистеина (Cys). Цистин в условиях проведения измерений предварительно окисляют до цистеиновой кислоты, устойчивой к кислотному гидролизу.

7.2 Проведение гидролиза проб

Для определения аминокислот по схеме испытаний 1 анализируемую пробу массой (0,100±0,001) г помещают в виалу для гидролиза (см. 5.2.7), добавляют 10,0 см соляной кислоты (см. 6.4.8). Виалу для гидролиза герметично закрывают завинчивающейся крышкой и перемешивают.

Для определения аминокислот по схеме испытаний 2 анализируемую пробу массой (0,100±0,001) г помещают в кварцевую или фарфоровую чашку (см. 5.2.11), добавляют 5,0 см свежеприготовленной окислительной смеси по 6.4.11 и выпаривают при постоянном перемешивании в струе теплого воздуха при температуре 60 °С досуха. Сухой остаток количественно переносят в виалу для гидролиза (см. 5.2.7), используя 10,0 см соляной кислоты (см. 6.4.8). Виалу для гидролиза герметично закрывают завинчивающейся крышкой и перемешивают.

Виалы для гидролиза устанавливают в сушильный шкаф (см. 5.2.3). Гидролиз проводят при температуре 110 °С в течение 14-16 ч.

По окончании гидролиза виалы для гидролиза вынимают из шкафа и охлаждают до комнатной температуры. Содержимое виал для гидролиза после охлаждения фильтруют через фильтры "синяя лента" (см. 5.2.16), отбросив первые порции и собирая фильтраты в посуду с крышками во избежание испарения. Далее переходят к получению ФТК-производных по 7.3.

7.3 Получение ФТК-производных аминокислот

В стеклянные бюксы (см. 5.2.10) вместимостью 10-15 см отбирают по 0,05 см подготовленных гидролизатов. Растворы выпаривают досуха в струе теплого воздуха. В каждый бюкс с сухими остатками добавляют 0,15 см раствора углекислого натрия (см. 6.4.9) и 0,3 см раствора ФИТЦ (см. 6.4.10). Тщательно перемешивают до растворения осадка, закрывают крышкой и оставляют на 35 мин при комнатной температуре. Затем растворы выпаривают досуха в струе теплого воздуха.

Необходимо строго соблюдать последовательность добавляемых растворов при получении ФТК-производных аминокислот.

Сухие остатки растворяют в 0,5 см дистиллированной воды (см. 5.3.1) и используют для анализа в течение рабочего дня.

Срок хранения сухих остатков в закрытых бюксах - не более 3 дней.

7.4 Проведение измерений

Подготовленные по 7.3 растворы переносят в пробирки типа Эппендорф (см. 5.2.6), центрифугируют (см. 5.2.2) в течение 5 мин при скорости вращения 5000 об/мин.

Капилляр готовят к работе в соответствии с 6.4.2, 6.4.3.

Для каждого подготовленного раствора регистрируют не менее двух электрофореграмм в условиях, указанных в таблице 2 для соответствующей схемы испытаний (см. 6.7.2). По окончании регистрации проверяют правильность автоматической разметки пиков. Используя программное обеспечение, проводят идентификацию аминокислот в пробе по совпадению времен их миграции в пробе и контрольном растворе при ширине окна идентификации не более 5%.

Если анализируемые аминокислоты обнаружены, то определяют их массовую концентрацию с использованием градуировочной характеристики, установленной по 6.7.2.

Для каждой из аминокислот проверяют выполнение условия по формуле (1).

Если измеренные значения массовой концентрации одной или нескольких аминокислот превышают верхнюю границу диапазона градуировочной характеристики, то необходимо разбавить раствор дистиллированной водой так, чтобы значение массовой концентрации в полученном растворе находилось в середине диапазона измеряемых значений.