9.1 Приготовление стеринов
9.1.1 Приготовление дигитонина стеринов анализируемого продукта (пробы)
9.1.1.1 Навеску жира массой (15,0±0,1) г, подготовленную по 7.1.8, вносят в коническую колбу вместимостью 500 см
, добавляют 10 см гидроокиси калия и 20 см этилового спирта. Присоединяют к колбе воздушный конденсатор. Нагревают смесь на водяной бане в течение 30 мин при непрерывном вращении колбы до получения прозрачного раствора.
Далее добавляют 60 см воды, затем 180 см этилового спирта. Нагревают смесь до 40 °С. Добавляют 30 см спиртового раствора дигитонина, перемешивают и охлаждают в холодильнике при температуре 5 °С в течение 12 ч.
9.1.1.2 Дигитонин стерина выделяют из полученного раствора, пропуская его через фильтрующее устройство - фильтровальную бумагу и фильтрующую воронку диаметром фильтра 90 мм.
Промывают фильтрат водой температурой 5 °С до прекращения пенообразования, после чего промывают фильтрат, используя от 25 до 50 см этилового спирта. Затем промывают фильтрат, используя от 25 до 50 см диэтилового эфира.
Фильтровальную бумагу и полученный осадок высушивают при температуре (102±2) °С в течение 10-15 мин. Сухой остаток на фильтре является дигитонином стерина.
Дигитонин стерина отделяют от фильтра и переносят его в стеклянную бюксу.
9.1.2 Приготовление стеринов молочного жира
9.1.2.1 Навеску молочного жира массой (15,0±0,1) г вносят в коническую колбу вместимостью 500 см, добавляют 10 см гидроокиси калия и 20 см этилового спирта. Присоединяют к колбе воздушный конденсатор. Нагревают смесь на водяной бане в течение 30 мин при непрерывном вращении колбы до получения прозрачного раствора.
Далее добавляют 60 см воды, затем 180 см этилового спирта. Нагревают смесь до 40 °С. Добавляют 30 см спиртового раствора дигитонина, перемешивают и охлаждают в холодильнике при температуре 5 °С в течение 12 ч.
9.1.2.2 Стерин молочного жира выделяют из полученного раствора согласно 9.1.1.2. Сухой остаток на фильтре является стерином молочного жира, который отделяют от фильтра и переносят его в стеклянную бюксу.
9.1.3 Приготовление стеринов рапсового масла
9.1.3.1 Навеску рапсового масла массой (15,0±0,1) г вносят в коническую колбу вместимостью 500 см, добавляют 10 см гидроокиси калия и 20 см этилового спирта. Присоединяют к колбе воздушный конденсатор. Нагревают смесь на водяной бане в течение 30 мин при непрерывном вращении колбы до получения прозрачного раствора.
Далее добавляют 60 см воды, затем 180 см этилового спирта. Нагревают смесь до 40 °С. Добавляют 30 см спиртового раствора дигитонина, перемешивают и охлаждают в холодильнике при температуре 5 °С в течение 12 ч.
9.1.3.2 Стерины рапсового масла выделяют из полученного раствора согласно 9.1.1.2. Сухой остаток на фильтре является стеринами рапсового масла, которые отделяют от фильтра и переносят в стеклянную бюксу.
9.1.4 Приготовление стеринов соевого масла
9.1.4.1 Навеску соевого масла массой (15,0±0,1) г вносят в коническую колбу вместимостью 500 см, добавляют 10 см гидроокиси калия и 20 см этилового спирта. Присоединяют к колбе воздушный конденсатор. Нагревают смесь на водяной бане в течение 30 мин при непрерывном вращении колбы до получения прозрачного раствора.
Далее добавляют 60 см воды, затем 180 см этилового спирта. Нагревают смесь до 40 °С. Добавляют 30 см спиртового раствора дигитонина, перемешивают и охлаждают в холодильнике при температуре 5 °С в течение 12 ч.
9.1.4.2 Стерины соевого масла выделяют из полученного раствора согласно 9.1.1.2. Сухой остаток на фильтре является стеринами соевого масла, которые отделяют от фильтра и переносят в стеклянную бюксу.
9.2 Подготовка хроматографа
Подготовку хроматографа к работе проводят в соответствии с прилагаемой к хроматографу инструкцией.
9.3 Условия хроматографирования
9.3.1 Установка чувствительности хроматографа
Дозатором вводят в колонку от 3·10
до 5·10 см раствора для контроля чувствительности (1 мг свежеприготовленных стеринов молочного жира по 9.1.2. и 1 см н-пентана). При этом на хроматограмме должен появиться один пик, соответствующий холестерину (приложение А, рисунок А.1). Устанавливают скорость диаграммы, чувствительность детектора и характеристики спектра так, чтобы высота пика хроматограммы холестерина была не менее 50% верхнего предела регистрации записывающего устройства.
9.3.2 Определение эффективности разделения стеринов
Дозатором вводят в колонку от 3·10 до 5·10 см раствора для проверки эффективности разделения (состоит из 0,9 мг стеринов рапсового масла, подготовленных по 9.1.3, 0,1 мг стеринов молочного жира, подготовленных по 9.1.2, и 1 см н-пентана). На хроматограмме должны появиться пики холестерина, брассикастерина, кампестерина и 
-ситостерина (приложение А, рисунок А.2). Измеряют на хроматограмме расстояния, пропорциональные времени удерживания (расстояния от момента введения раствора в колонку до наивысших точек пиков): 
- для холестерина, 
- для брассикастерина, 
- для кампестерина, 
- для -ситостерина. Измеряют ширину оснований пиков и расстояния между вершинами пиков (измерение ширины оснований проводят между пересечениями основной линии с касательными к точкам перегиба с передней и задней сторон вершин), 
- для холестерина и 
- для брассикастерина.
Коэффициент разделения рассчитывают по формуле
