ГОСТ 31674-2012 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности (с Изменением N 1)

     4.1.2 Подготовка к проведению испытаний

4.1.2.1 Для изготовления блока луночных микроаквариумов (рисунок 1) используют пластины органического стекла с размерами 15x8,5x1,3 см. В пластине высверливают с последующей полировкой 5 рядов по 9 лунок. Диаметр каждой лунки - 1,2 см верхний и 0,8 см нижний, глубина - 0,7 см. Рабочий объем каждой лунки - 0,4 см. Вместо блока микроаквариумов можно использовать микробиологические предметные стекла с отшлифованной лункой вместимостью 0,2 см (по 5 шт. на пробу).

     
Рисунок 1 - Блок луночных микроаквариумов

4.1.2.2 Порядок обработки посуды для проведения испытаний должен быть следующим. Вся посуда и блоки микроаквариумов, необходимые для биотестирования, должны быть химически чистыми и использоваться только для данного анализа. В качестве моющего средства допускается к применению только хозяйственное мыло и мыльный раствор.

Чашки Петри и колбы для приготовления раствора Лозина-Лозинского прокаливают в сушильном шкафу в течение 2 ч при температуре от 120 °C до 150 °C. Блоки из органического стекла сушат только на воздухе. Дистилляцию воды для биотестирования необходимо проводить в химически чистом помещении.

4.1.2.3 Приготовление рабочего раствора питательной среды для культивирования стилонихий и разбавления ацетоновых экстрактов образцов кормов проводят в следующем порядке. Средой для культивирования инфузорий и разбавления ацетоновых экстрактов кормов служит раствор Лозина-Лозинского следующего состава: NaCl - 0,01%-ный; KCl - 0,001%-ный; CaCl 2-водный - 0,001%-ный; MgCl 6-водный - 0,001%-ный; NaHCO - 0,002%-ный.

Для удобства сначала готовят десятикратный концентрированный раствор. Для этого в дистиллированной воде растворяют 1,0 г хлористого натрия; 0,1 г хлористого калия; 0,1 г 7-водного хлористого магния; 0,1 г 2-водного хлористого кальция; 0,2 г кислого углекислого натрия и доводят объем до 1 дм. Полученный раствор хранят не более 1 мес в холодильнике в стерильной колбе под ватно-марлевой пробкой.

Рабочий раствор Лозина-Лозинского готовят путем разбавления в 10 раз (1:9) концентрированной среды дистиллированной водой. Рабочий раствор хранят не более 14 сут при комнатной температуре.

4.1.2.4 Для приготовления модельного токсиканта берут 10 мг 5-водной сернокислой меди, растворяют ее в дистиллированной воде и доводят объем до 1 дм. Срок хранения раствора модельного токсиканта - не более 7 сут в холодильнике в стерильной колбе.

Рабочие концентрации модельного токсиканта готовят последовательным десятикратным его разбавлением в день проведения анализа. Сначала до концентрации 1 мг/дм раствор разбавляют дистиллированной водой, а затем до концентрации 0,1 мг/дм - раствором Лозина-Лозинского.

Рабочая концентрация - 0,1 мг/дм. Рабочий раствор используют только свежеприготовленным.

4.1.2.5 Приготовление корма для стилонихий проводят в следующем порядке. Свежие хлебопекарные дрожжи предварительно тестируют на общую токсичность. Затем навеску массой 50 г измельчают и высушивают в сушильном шкафу при температуре от 50 °C до 55 °C в течение 2 сут.

Хранят готовые дрожжи в стерильной банке с притертой крышкой в сухом прохладном месте не более 12 мес, избегая попадания прямых солнечных лучей и насыщения дрожжей атмосферной влагой.

4.1.2.6 Культивирование стилонихий и тестирование кормов проводят в отдельном помещении, изолированном от химических токсичных реактивов (особенно от летучих соединений, хорошо растворимых в воде). В стерильную чашку Петри вносят 25 см рабочего раствора Лозина-Лозинского, затем пипеткой переносят в нее массу стилонихий. При этом кончик пипетки, заполненный культурой стилонихии, нужно предварительно погрузить в чашку Петри с рабочим раствором Лозина-Лозинского. Туда же в качестве корма для стилонихий на кончике иглы, продезинфицированной 70%-ным раствором этилового спирта, вносят 0,003 г высушенных дрожжей (2-3 крошки диаметром 1-2 мм). Чашку Петри помещают в термостат для культивирования стилонихий при температуре от 22 °C до 24 °C. Пересев культуры для хранения проводят 2 раза в неделю.

Допускается культивирование стилонихий вне термостата при температуре от 18 °C до 24 °C. В этом случае для поддержания постоянной температуры используют кондиционер или лампу дневного света, установленную на определенном расстоянии от чашек Петри, обеспечивающем заданную температуру. Лампу вместе с чашками накрывают полиэтиленовой пленкой, создав подобие теплички, где температура должна быть постоянной. Во избежание попадания прямых солнечных лучей чашки Петри накрывают бумагой.

Необходимо учитывать, что культура стилонихий не обладает генетической стабильностью. Приблизительно через год-полтора работы с культурой она стареет, теряет однородность, жизнеспособность, подвижность, неадекватно реагирует на токсиканты. В этом случае необходимо раз в год подсаживать свежий клон стилонихий к старой культуре или полностью заменять ее на новую. С целью замедления процесса вырождения культуры стилонихий при пересадке на свежую среду необходимо отбирать не только из предыдущей чашки Петри суточную культуру, но и из двух резервных чашек Петри с двух-, трехсуточными культурами, в которых инфузории имеют наибольшую подвижность и плотность.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.1.2.7 Подготовку тест-организмов проводят в следующем порядке. Для биотестирования используют только суточную культуру стилонихий, находящуюся в фазе экспоненциального (активного) роста. С этой целью за сутки до анализа массу стилонихий пересаживают в новую питательную среду с кормом и помещают в термостат при оптимальной температуре от 22 °C до 24 °C. При этом стилонихии активно размножаются и концентрируются вокруг корма.

Не допускается использовать культуру стилонихий, зараженную другими видами простейших, микроскопическими грибами или бактериями, что может произойти при использовании нестерильной посуды, плохо подсушенных или просроченных дрожжей.

Для получения достоверных результатов биотестирования необходимо регулярно проверять состояние стилонихий, их подвижность, а один раз в месяц - реакцию культуры на действие модельного токсиканта (4.1.2.4), для чего каплю со стилонихиями помещают в лунку предметного стекла и после подсчета их количества заливают 0,2 см раствора модельного токсиканта рабочей концентрации 0,1 мг/дм. Через 30 мин подсчитывают количество оставшихся живыми стилонихий. Результат считают удовлетворительным, если выживают не менее 50% стилонихий.

4.1.2.8 Подготовку исследуемого корма проводят в следующем порядке. Среднюю пробу исследуемого корма измельчают и просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

4.1.2.9 Приготовление водного раствора ацетонового экстракта проводят в следующем порядке. Пробу исследуемого корма массой (10±0,1) г помещают в пробирку с пришлифованной пробкой вместимостью 25 см или в коническую колбу со шлифом вместимостью 50 или 100 см и заливают определенным количеством ацетона в зависимости от вида исследуемого корма.

Для получения ацетонового экстракта пробирку или коническую колбу энергично встряхивают не менее 2 мин вручную или, при одновременной постановке нескольких проб, не менее 20 мин на аппарате для встряхивания жидкостей, а затем отстаивают в течение не менее 10 мин и не более 15 мин.

При высокой набухаемости (гигроскопичности) исследуемого корма допускается увеличивать количество ацетона на 5-10 см таким образом, чтобы толщина слоя ацетона над кормом была не менее 2 мм. Раствор вновь взбалтывают в течение 2 мин. После повторного отстаивания в течение 10 мин осторожно отбирают автоматической пипеткой или шприцем с длинной иглой 0,5 см полученной надосадочной жидкости экстрактов и переносят ее в химический стакан или колбу с водным раствором Лозина-Лозинского.

Все параметры приготовления водного раствора ацетонового экстракта в зависимости от вида исследуемого корма представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Приготовление водного раствора ацетонового экстракта