Методические рекомендации по применению методов биотестирования для оценки качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения

ПРИЛОЖЕНИЕ 2: БИОТЕСТИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНФУЗОРИЙ PARAMECIUM

1. Принцип метода

Методика биотестового анализа водных проб основана на способности Paramecium caudatum - инфузории туфельки (далее - инфузории) избегать неблагоприятных и опасных для жизнедеятельности зон и активно перемещаться по градиентам концентраций химических веществ в зоны благоприятные (реакция хемотаксиса). Методика позволяет оперативно определять острую токсичность водных проб.

2. Характеристика тест-объекта, выращивание и подготовка культуры к анализу

2.1. В качестве тест-объекта используется Paramecium caudatum - инфузория туфелька. Относится к подцарству простейших (одноклеточных животных) - Protozoa, типу - Ciliophora. Инфузория широко распространена в пресных водоемах. Форма клетки эллипсоидная, размеры - 200х40 мкм. Основную пищу инфузории составляют бактерии, дрожжи и т.п. Размножение инфузории происходит путем поперечного деления клетки. В зависимости от условий выращивания время генерации может составлять от нескольких часов до нескольких суток.

По сравнению с другими группами простейших инфузории имеют наиболее сложное строение и отличаются разнообразием функций. Инфузория находится в непрерывном движении. Скорость ее при комнатной температуре - 2,0-2,5 мм/с. Траектория движения сложная: она движется вперед, вращаясь вдоль продольной оси тела, с помощью ресничек, количество которых достигает 10-15 тысяч. Изменение внешних условий (температура, химический состав среды, электромагнитные колебания и другие факторы) воспринимаются клеткой, и первая ответная реакция - изменение характера движения: уменьшение или увеличение скорости, частоты остановок и разворотов, разнообразные таксисы, например, гео-, магнито-, аэро-, хемотаксис.

2.2. Исходный материал для выращивания культуры инфузории передается при поставке прибора "БИОТЕСТЕР-2". Культуру можно также получить из коллекций культуры простейших, имеющихся в различных научных организациях (например, в БиНИИ СПб ГУ: 198904; Старый Петергоф, Ораниенбаумское шоссе, 2). Можно выделить свою культуру из местных водоемов или приобрести у аквариумистов, но необходимо при этом учитывать, что видовую принадлежность может определить специалист-протозоолог, т.к. существуют другие представители рода Paramecium caudatum.

2.3. Выращивание культуры

2.3.1. В данной методике может быть использована культура инфузории, выращенная по различным методикам, которые обеспечивают получение тест-объекта, во-первых, в достаточном для анализов количестве, во-вторых, чувствительного к модельному токсиканту в пределах концентраций, установленных в п.2.3.

Выращивание культуры проводят в любых удобных сосудах, например, в стеклянных колбах, стаканах, чашках Петри и других. В качестве корма используют бактерии, дрожжи и их смесь, выращенные стерильно на твердых средах. При отсутствии условий для выращивания стерильного корма, можно использовать воздушносухие пекарские дрожжи.

К общим положениям по выращиванию культуры относится обязательное требование идентичности среды выращивания и среды, которая будет использована для процедур отмывания культуры от продуктов метаболизма, получения рабочей взвеси, разведения водных проб и прочих процедур с культурой.

Метод культивирования инфузории приведен ниже в качестве примера.

2.3.2. Метод культивирования инфузории

В широкогорлую коническую колбу на 200 мл вносят суспензию инфузорий в среде Лозина-Лозинского в количестве 100 мл с плотностью 1000±200 клеток/мл. В качестве корма добавляют воздушносухие дрожжи из расчета 1 мг на 1 мл среды. Выращивание ведут при температуре 18-26 °С.

Для биотестового анализа используют культуру в начале стационарной фазы роста. Для контроля за развитием популяции отбирают ежесуточно пробу, в которой определяют количество клеток по п.2.3.4.1. Отсутствие прироста клеток в популяции свидетельствует о наступлении стационарной фазы роста, ежесуточный контроль позволяет определить ее начало. Обычно при заданных в начале данного раздела условиях стационарная фаза роста наступает на 2-3 сутки, при этом плотность культуры будет составлять 4000±1000 клеток/мл.

2.3.3. Поддержание и хранение культуры

При перерывах в проведении биотестовых анализов культуру достаточно поддерживать только как посевной материал. Один из способов поддержания - на зернах риса. В чашку Петри помещают 2-3 сырых зернышка риса, добавляют среду около 30-40 мл и помещают клетки инфузории туфельки в количестве 50-100 клеток/мл. Раз в 2 недели меняют среду и зерна риса.

Удобно содержать резервную культуру в пробирках. Один раз за 7-10 суток концентрат клеток из верхней части пробирки (без перемешивания) переливают в другую пробирку, добавляют среду Л-Л до прежнего объема и по 0,5 мг дрожжей на 1 мл жидкости.

Другой способ консервации культуры - хранение в холодильнике при низких положительных температурах. Скорость деления при этом может составлять одно деление в 10-20 суток. Культуру отмывают от продуктов метаболизма и старого корма, доводят концентрацию взвеси до 200±100 клеток/мл, добавляют сухие дрожжи 0,2 мг/мл и помещают в холодильник. Так культура сохраняется до месяца. При использовании культуры, сохранявшейся в холодильнике, необходимо дождаться выравнивания ее температуры с температурой остальных растворов и только после этого производить необходимые процедуры.

Особое внимание следует обратить на то, что инфузория не выдерживает резких перепадов температуры (!).

2.3.4. Определение концентрации взвеси инфузории

Концентрацию клеток необходимо определять в процессе выращивания культуры, при подготовке рабочей взвеси клеток и для определения величины тест-реакции. Определение концентрации клеток инфузорий без затруднений выполняется с помощью отградуированного прибора серии "Биотестер".

2.3.4.1. В общем случае концентрацию клеток инфузории определяют подсчетом клеток под микроскопом по общепринятым в микробиологической практике методикам: с помощью измерительных сеток, счетных камер и т.п. Подсчитанное количество клеток пересчитывают на единицу объема среды и выражают как концентрацию (клеток/мл). Ниже приводится пример способа подсчета клеток инфузорий. Исходную взвесь инфузорий взболтать, отобрать с помощью пипетки 0,5 мл взвеси. К этому объему добавить 9,5 мл 1% раствора NaCI. Таким путем достигается обездвиживание инфузорий. Не дожидаясь полного обездвиживания инфузорий (примерно через 2-5 мин) из разбавленной взвеси отбирают 0,5 мл и распределяют этот объем в виде 6-10 крупных капель на сухом стекле (например, в чашке Петри). С помощью микроскопа (лупы) подсчитывают инфузории во всех каплях. Полученный результат пересчитывают на 1 мл исходной взвеси.

Например: 0,5 мл взвеси обездвиженных инфузорий распределены в 6 каплях, в которых было сосчитано 29, 38, 32, 31, 28, 35 клеток - всего 193. В 1 мл разбавленной взвеси содержится 386 клеток, а в 1 мл исходной взвеси, следовательно, будет содержаться 3860 клеток инфузорий.

2.3.4.2. Специализированным средством для определения количества подвижных клеток инфузории является прибор серии "Биотестер". Определение концентрации подвижных клеток проводят по предварительно построенной градировочной кривой.

Для построения градировочной кривой берут взвесь клеток инфузории в среде Л-Л по п.2.3.2. Из взвеси готовят ряд разведений, каждое из которых по концентрации меньше предыдущего в 2 раза, объем взвеси каждого разведения не менее 5 мл. Последнее разведение может содержать 5-10 кпеток/мл. Исходную концентрацию клеток определяют подсчетом числа клеток под микроскопом (см.п.2.3.4.1). Концентрации клеток в серии разведений определяют соответствующим расчетом. При этом последовательно определяют концентрацию подвижных клеток инфузорий, находящихся в исходной рабочей взвеси и во всех разведениях, снимая показания на приборе. Для этого заполняют кювету контролируемой взвесью клеток до верха (инфузории не обездвиживать!), помещают в кюветный модуль прибора и снимают ряд показаний.

Процедуру подсчета клеток в исходной взвеси, приготовление разведений, измерение на приборе исходной взвеси и разведений повторяют не менее 3 раз и результаты усредняют. По полученным данным строят градировочную кривую как зависимость показаний прибора от логарифма концентрации клеток. Построенная кривая может быть использована продолжительное время с одним и тем же измерительным прибором.

2.4. Подготовка инфузорий к анализу

2.4.1. Выращенную по п.2.3 культуру инфузории отмывают от продуктов метаболизма и корма, доводят концентрацию до рабочего значения, проводят проверку готовности культуры к анализу по ее чувствительности к модельному токсиканту и по ее способности выходить в чистую пробу.