ГОСТ ISO 16140-2011 Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов

     6 Количественные методы. Технический протокол валидации

6.1 Общие требования

Число колоний микроорганизмов в данном образце является наиболее распространенным результатом стандартных количественных методов. Записывают всю информацию - массу образца, серию разбавления, объем посевного материала и число колоний при каждом разбавлении. В микробиологии эти дискретные данные часто сокращают, например, проводят подсчет колоний только в чашках, содержащих менее 300 колоний, потом для получения конечного результата используют коэффициент расширения, обратно пропорциональный коэффициенту разбавления. Из-за наличия других факторов, влияющих на процесс роста микроорганизмов, а также в целях получения симметричного распределения или квазинормального распределения данные подсчета часто преобразуют в логарифмический вид или в значения квадратного корня. Целесообразность такого преобразования можно проверить, используя гистограммы с набором экспериментальных точек (30 или более), полученных при одинаковых условиях.

Разделы 6.2 и 6.3, в основном, относятся к валидации количественных методов сбора непрерывных данных (или данных в интервале значений), при этом отдельно включены замечания по подсчету числа микроорганизмов.

6.2 Сравнительное исследование методов

6.2.1 Линейность и относительная точность

6.2.1.1 Определения

6.2.1.1.1 линейность (linearity): Способность метода при использовании с заданной матрицей давать результаты, пропорциональные количеству аналита в образце, т.е. увеличению аналита соответствует линейное или пропорциональное увеличение результатов.

Примечание 1 - Характеристику результата или сигнальную функцию получают путем измерения зависимости сигнала или результата метода от концентрации аналита (доз) в различных образцах референтных материалов () с известными характеристиками. В микробиологии, где стабильный референтный материал практически отсутствует, эти "известные характеристики" можно получить путем многократных повторных измерений с использованием референтного метода.

После подгонки, сглаживания или обработки другим алгоритмом данных разработчик альтернативного метода должен создать монотонную модель во всей области применения метода для преобразования результатов измерений в значения, наиболее близкие к стандартным результатам. Подгоночная модель является первой (или исходной) градуировочной характеристикой и включает все градуировочные коэффициенты в области концентраций; она часто нелинейна. Но эти аспекты не включены в процедуру валидации.

Частью процедуры валидации является проверка градуировки, которая дает конечную градуировочную характеристику, устанавливающую соотношение между преобразованными результатами измерений и соответствующими "стандартными значениями" в одинаковой системе единиц. При использовании одинаковых шкал на осях эта характеристика должна быть линейной с отсекаемым на оси отрезком, равным нулю (одинаковыми наименьшими значениями), и наклоном 1 (при одинаковых масштабных единицах по осям) и правильно оцененными характеристиками разброса.

_________________

Их получают по стандартному методу с естественно контаминированными образцами, если недоступны референтные материалы и известные значения.

Не следует проводить экстраполяцию выше и ниже испытательных концентраций, кроме случаев, когда нужно изучить поведение вблизи "нулевой" концентрации.

Примечание 2 - При обработке результатов подсчетов микроорганизмов с помощью метода регрессии линейность не всегда правильно достигается для результатов подсчета, соответствующих низким уровням или широким диапазонам. Такие результаты подсчетов имеют квазипуассоновские распределения со среднеквадратическим отклонением воспроизводимости, пропорциональным корню квадратному из среднего подсчитанного числа микроорганизмов. При этом возникают те же трудности оценки, которые упомянуты в примечании к пункту 6.2.2.1.

6.2.1.1.2 точность (accuracy): Близость результатов испытания к принятому опорному значению величины (ISO 3534-1).

Примечание - Термин "точность", когда он относится к серии результатов испытаний, включает в себя сочетание случайных составляющих и общей систематической погрешности (смещения).

6.2.1.1.3 смещение (систематическая погрешность) (bias): Разность между математически ожидаемым результатом испытания и принятым опорным значением (ISO 3534-1).

Примечание - Смещение есть полная систематическая погрешность в отличие от случайной погрешности. Могут быть одна или несколько составляющих систематической погрешности, дающих вклад в смещение. Большему систематическому отклонению от принятого опорного значения соответствует большее значение систематической погрешности.

6.2.1.1.4 относительная точность () (relative accuracy): Степень соответствия между результатом, полученным референтным методом, и результатом, полученным альтернативным методом, при исследовании идентичных образцов (см. 5.1.1.1.1).

6.2.1.2 Протокол измерений

6.2.1.2.1 План

Для проверки градуировочной характеристики требуется большое число различных образцов (при возможности, референтные материалы - см. приложение С) и исследование нескольких уровней (доз или концентраций) в зависимости от диапазона концентраций для практического использования.

Для определения градуировочной характеристики требуется использование минимум пяти различных уровней аналита для каждого типа пищевого продукта. Уровни должны равномерно распределяться по всему исследуемому диапазону, включающему минимальный (равный или не равный нулю), центральный, максимальный и два промежуточных уровня. Шкалу следует выбрать до того, как выбраны уровни концентрации, и с учетом диапазона контаминации и ожидаемого предела обнаружения (): линейную - для небольших диапазонов (например, или от до ), включающих ноль, и логарифмическую - для широких диапазонов (например, ). При этом может измениться соотношение между среднеквадратическими отклонениями и средними значениями результатов (см. примечание в п.6.2.1.3.1).

_________________

Графические примеры неприемлемых и приемлемых распределений результатов измерений приведены в приложении Р.

Приоритет отдается естественно контаминированным образцам. Термин "уровень" используется в значении концентрации аналита, предполагаемой априори. В принципе, оптимальный план для регрессионного анализа получают путем выбора подходящего и уместного диапазона концентраций аналита, исключения исследования образцов с аналогичными подсчетами микроорганизмов или исключения повторяющихся данных с одинаковыми результатами. Для жидкостей диапазон может быть получен путем разведений, но необходимо обеспечить гомогенность как жидких, так и твердых образцов.

Образцы на одном уровне должны быть независимо продублированы путем подготовки подобразцов. На каждом уровне анализируют одинаковое число подобразцов - по меньшей мере два, а в идеальном случае - от 5 до 10. Когда и в референтном, и в альтернативном методах используют одни и те же десятикратные разведения подобразцов, испытания дублируют на уровне чашек Петри (см. случай 1 приложения М). Когда десятикратные разбавления нужно проводить только в референтном методе, проводят исследование дублирующих образцов (см. случай 2 приложения М).

Чашки Петри в двух дупликациях засевают каждым десятикратным разбавлением.