МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МИКРОКОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ, КОРМАХ И ВНЕШНЕЙ СРЕДЕ

Часть XI

ЭНЗИМНО-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ В РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРОДУКТАХ И БИОСУБСТРАТАХ

"УТВЕРЖДАЮ"

Заместитель Главного Государственного санитарного врача СССР А.И.Заиченко 19 октября 1979 г. N 2086-79

Метод позволяет определять большую часть фосфорорганических пестицидов, угнетающих холинэстеразу. Применение хроматографии в тонком слое, а также использование различных способов активации соединений дает возможность избирательно анализировать различные фосфорорганические пестициды и токсические продукты их превращений. Высокая чувствительность детектирования (0,1-5 нг) позволяет использовать аликвотные части экстрактов, что дает возможность исключить в ряде случаев очистку их, а также проводить хроматографирование каждой пробы в нескольких повторностях.

Модификация метода заключается в замене дефицитного сорбента силикагеля "Мерк" отечественным сорбентом силикагелем КСК и в разработке условий проявления на отечественном сорбенте.

     1. Характеристика действующих веществ

Фосфорорганические пестициды - эфиры фосфорной, тиофосфорной и дитиофосфорной кислот, угнетающих холинэстеразу.

Общие структурные формулы:

где - алкил

- ароматический или алифатический остаток

- водород или алкил

Фосфорные (ДДВФ и др.) и тиолфосфорнокислые эфиры (рицид, циодрин, фенитрооксон и др.) можно прямо энзиматически определять с большой чувствительностью, а тионфосфорнокислые эфиры (метафос, метилнитрофос, пиразофос, цианокс, фоксим и др.), дитиофосфаты (карбофос, фталофос, фозалон, фосфамид и др.), эфиры фосфоновой кислоты (хлорофос) необходимо предварительно активировать.

     2. Методика определения фосфорорганических пестицидов энзимно-хроматографическим методом

     2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении фосфорорганического пестицида из исследуемой пробы органическим растворителем, очистке, если необходимо, охлажденным ацетоном и определении методом хроматографии в тонком слое с энзимным проявлением без активации или после активации препарата на пластинке. Препараты, угнетающие холинэстеразу, проявляются в виде белых пятой на голубом фоне. Чувствительность обнаружения ФОП 0,0001-0,001 мкг. Количественное определение производят путем сравнения размера пятен проб и стандарта.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

- Диапазон определяемых концентраций 0,1-50 мкг пестицидов в анализируемой пробе

- Предел обнаружения 0,0001-0,001 мкг в зависимости от исследуемого пестицида (см. табл.2)

- Размах варьирования 77-113%

- Среднее значение определения стандартных количеств пестицидов - 92%

- Стандартное отклонение 12,7%

- Относительное стандартное отклонение 0,14

- Доверительный интервал среднего при 0,95 и 592±15,7.

Метод специфичен для соединений, угнетающих холинэстеразу.

     2.2. Реактивы и растворы

Ацетон, х.ч.

Натрий сернокислый безводный, ч.д.а.

Н-гексан, х.ч.

Этиловый спирт ректификат

Бром

Натрий серноватистокислый - 0,1 М водный раствор (2,48 г растворяют в 100 мл воды).

Силикагель марки КСК, дробленный и просеянный через сито 100 меш

Кальций сернокислый (CaSO·2НО), ч.д.а., просушенный в сушильном шкафу при температуре 160 °С в течение 6 часов

Индоксилацетат, ч.д.а., ТУ-7П-57-69

Калий железосинеродистый - 0,05 М водный раствор (1,645 г растворяют в 100 мл дистиллированной воды)

Калий железистосинеродистый - 0,05 М водный раствор (2,11 г растворяют в 100 мл дистиллированной воды)

Буферный раствор рН - 8,69 - готовят смесь ортофосфорной (2,1 мл), уксусной (2,3 мл), борной (2,47 г) кислот и доводят дистиллированной водой до 1 л. Для получения буфера с рН 8,69 к 100 мл указанной смеси прибавляют 65 мл 0,2 н раствора едкого натра, который готовят растворением 0,800 г NaОН в дистиллированной воде в мерной колбе емкостью 100 мл.

Ферментный препарат получают из печени крупного рогатого скота (свежую, однократно замороженную и сохраняемую в дальнейшем в холодильнике печень можно использовать в течение 6 месяцев). Для приготовления ферментного раствора 1 г печени растирают в ступке с 9 мл буферного раствора, фильтруют через вату. К 1 мл полученной сыворотки прибавляют 4 мл буферного раствора и используют этот раствор для опрыскивания пластинок. Используют свежеприготовленный раствор.

Основной стандартный раствор (А) исследуемого фосфорорганического пестицида - 100 мкг/мл (10 мг пестицида в 100 мл ацетона).

Рабочие стандартные растворы готовят разбавлением основного раствора "А".

Раствор "Б" - 0,5 мл раствора "А" доводят в мерной колбе до 100 мл ацетоном (содержание пестицида составляет 0,5 мкг/мл).

Раствор "В" - 5 мл раствора "Б" доводят в мерной колбе до 25 мл (содержание препарата 0,1 мкг/мл).

Проявляющий реактив: 10 мг индоксилацетата растворяют в 6 мл этанола, прибавляют 6 мл буферного раствора, 2 мл раствора железосинеродистого калия и 2 мл железистосинеродистого калия и хорошо перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед опрыскиванием. На пластинку расходуется 3-4 мл смеси.