Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов

3.1. Изучение действия пестицидов на репродуктивную функцию животных

3.1.1. Изучение плодовитости и общей репродуктивной функции. Изучение плодовитости и общей репродуктивной функции в эксперименте на двух поколениях предполагает выявление действия пестицидов на функцию гонад, эстральный цикл, процессы оплодотворения и спаривания, течение беременности, родов, лактацию.

Для таких экспериментов обычно используют один из видов грызунов (крысы, мыши, хомяки) ввиду раннего наступления половой зрелости, короткого периода беременности и лактации. Исследования не должны ограничиваться опытами на грызунах, если другие виды животных могут обеспечить информацию, более адекватную для человека.

Исходное количество животных в опытной и контрольной группах ( - родительское поколение) должно составлять 10 самцов и 20 самок, достигших половой зрелости (табл.3.1). Животных подсаживают в соотношении 1 : , факт беременности у крыс и хомяков устанавливается по наличию сперматозоидов во влагалищном мазке на фоне стадии эструс, а у мышей - по влагалищной пробке.

Таблица 3.1

Продолжительность основных физиологических периодов, характеризующих репродуктивную функцию у некоторых грызунов, дни

День обнаружения сперматозоидов во влагалище у крыс или вагинальной пробки у мышей принимается за нулевой день беременности.

Воздействие на родительское поколение начинается с нулевого дня беременности и продолжается непрерывно до окончания вскармливания   помета. При этом обеспечивается непрерывное влияние пестицида как на эмбриональное, так и постнатальное развитие помета, являющегося родительским поколением. Таким образом, эта схема предусматривает воздействие вредного фактора на гонады поколения, начиная со стадии внутриутробного развития гамет.

Схема проведения эксперимента (тест нескольких поколений)*

________________

* Wright Paul L, Test Procedures to Evaluate Effects of Chemical Exposure on Fertility and Reproduction Enviren. Health Perspec. 1978, 24, 39-43.

Исследуемые дозы должны быть близки к реальным или к пороговым по общетоксическому действию в хроническом эксперименте.

После достижения животными зрелости (см. табл.3.1) их спаривают (30 и 15 ) и получают потомство . Десять беременных самок умерщвляют на 20-й день беременности, при этом учитывается количество живых плодов, наличие у них грубых аномалий развития, а также плодов, погибших до и после имплантации (табл.3.2).

Двадцать самок оставляют до естественных родов, после чего определяют число живых и мертворожденных плодов, массу их тела, а также учитывают динамику массы и выживаемость молодняка на 4-й и 21-й дни после рождения.

Через 10 дней после окончания вскармливания потомства родительское поколение (оставшиеся 20 и 10 ) вновь спаривается для получения помета. При этом учитывают те же показатели. Полученные данные обрабатывают статистически, сравнивают с контролем и регистрируют в соответствующей таблице.

Изменения указанных критериев служат основанием для заключения о нарушении репродуктивной функции при воздействии изучаемых препаратов, что необходимо принимать во внимание при гигиеническом нормировании.

3.1.2. Изучение эмбриотоксического и тератогенного действия. При проведении этих исследований, как и предыдущих, в качестве биологической модели обычно также используются грызуны. Количество беременных самок - не менее 20 как в опытной, так и в контрольной группах.

С целью выявления эмбриотоксического и тератогенного эффектов вводятся максимально переносимые дозы или концентрации пестицида в период активного органогенеза, протекающего у каждого вида животных в указанные сроки (табл.3.1), а также в течение всей беременности в дозах на уровне подпороговых в хроническом токсикологическом эксперименте или на уровне максимально допустимой суточной дозы для человека ().

Повреждающее действие химического фактора учитывается как при забое беременных самок на 20-й день беременности, так и по состоянию потомства в постнатальный период развития. Некоторых самок оставляют до естественных родов. Учитывают продолжительность беременности, количество новорожденных в помете, массу и краниокаудальный размер плодов, развитие молодняка на протяжении 1-2 месяцев.

При забое определяется количество желтых тел в яичниках, количество живых плодов и их масса, плодов, погибших до и после имплантации, соотношение самок и самцов в помете. Первостепенным в оценке тератогенного действия веществ является выявление грубых аномалий развития, аномалий внутренних органов и скелета.

С этой целью можно рекомендовать методы Вильсона в модификации отдела эмбриологии ИЭМ АМН СССР и висцерального исследования органов нефиксированных плодов, который описан далее.

Преимуществом последнего метода является то, что наряду с отсутствием стадии двухнедельной предварительной фиксации плодов имеется возможность обнаружения аномалий развития, не выявляемых методом Вильсона, т.е. сокращение сроков и повышение эффективности исследований.

Висцеральное исследование органов плода продолжается около 3 мин, поэтому в гораздо более короткие сроки (в день забоя животных) можно предварительно оценить наличие и степень выраженности тератогенного эффекта исследуемого вещества. Кроме того, при использовании данного метода исследованию костной системы подвергаются все плоды без исключения, а по методу Вильсона - только 50% плодов.

Для исследования плодов этим методом необходимо следующее оборудование: а) микроскоп стереоскопический (МБС-9); б) весы лабораторные технические (типа ВЛТ-500); в) глазные ножницы - 2 пары; г) глазные пинцеты анатомические - 2 шт.; д) парафиновый блок для фиксации плодов.

Реактивы: 96° этиловый спирт, глицерин, формалин; пикриновая кислота, ледяная уксусная кислота, едкий калий, красный ализарин.