Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов

2.2. Планирование токсикологического эксперимента, выбор показателей токсического действия и методов исследования

Цель токсикологических исследований - определение степени токсичности и опасности нового пестицида при однократном и многократном поступлении в организм через желудочно-кишечный тракт, дыхательные пути, неповрежденную кожу.

Исследования проводят на лабораторных животных - белых мышах, белых крысах, кроликах, кошках, морских свинках и других видах. Изучение нового вещества следует проводить не менее чем на 2 видах лабораторных животных различного пола (белые крысы и еще один вид в зависимости от особенностей пестицида). Перед началом острого эксперимента животных выдерживают на карантине в течение 7 дней, хронического - 14 дней. Животных содержат на кормовом режиме согласно существующему рациону и нормам, утвержденным Минздравом СССР. Средняя масса тела подопытных животных не должна превышать определенных пределов /табл.2.1/.

Таблица 2.1

Средняя масса тела животных, г

Количество животных, планируемых для постановки эксперимента, зависит от цели исследований (установление , , , порогов острого и хронического действия: , и др.) и указано в следующих далее разделах об изучении токсических свойств пестицидов при различных путях поступления. При определении количества животных, сроков исследования, интервалов варьирования доз необходимо исходить из математического планирования эксперимента.

При исследовании препаративных форм вещества следует учитывать содержание в них помимо действующего начала ряда других ингредиентов (растворителей, наполнителей и др.). Постановка эксперимента должна быть такой, чтобы животные контрольных групп получали содержащиеся в препарате ингредиенты (без активного начала), либо в одной из серий эксперимента - только действующее начало. Такая постановка опыта преследует цель выявить особенности возможного влияния других ингредиентов, входящих в товарные формы.

Для предварительного суждения о характере изменений, развивающихся в организме при действии пестицидов, детально изучают клинические проявления острой и хронической интоксикации у лабораторных животных. При этом учитывают поведение животных, поедание корма, сроки появления симптомов интоксикации и их характер. Следует обратить внимание на состояние шерстного и кожных покровов, слизистых оболочек, глаз (сужение зрачка, глазной щели, блефароспазм, экзофтальм, изменения конъюнктивы, роговицы, склеры), выделения из носа, полости рта, положение тела, частоту и характер дыхания, тип одышки (инспираторная, экспираторная, патологические формы), температуру тела, кожи, наличие мышечных подергиваний, тремора, характер возбудимости животного (реакции на звуковой, болевой, световой раздражители), судороги (клонические, клонико-тонические, тонические), непроизвольные мочеиспускание и дефекацию.

Показатели токсического воздействия пестицидов на функциональное состояние организма выбирают с учетом химической структуры пестицида и предполагаемого механизма действия, клинической картины интоксикации, сведений о действии близких по строению химических веществ. Предварительно изучают динамику изменений при однократном введении яда в желудок в дозе 1/2 , исследовании кумулятивных свойств при ежедневном введении в желудок в течение 2 мес. Изменения сравнивают с исходным фоном и данными контрольной группы.

Для выявления ранних признаков интоксикации проводят исследования, направленные на выяснение состояния организма и некоторых сторон механизма токсического действия пестицидов. Для этого изучают ряд интегральных и специфических показателей. В качестве таковых могут быть использованы: масса тела, работоспособность животных, состав периферической крови, состояние нервной (поведенческие реакции, условные рефлексы, порог нервно-мышечной возбудимости, скорость проведения импульсов по нерву), сердечно-сосудистой и дыхательной (артериальное давление, ЭКГ и др.) систем, функциональное состояние печени, почек, эндокринных желез, симпатоадреналовой системы, окислительных процессов и др.

Для оценки функционального состояния печени рекомендуется использовать следующие основные пробы. Обезвреживающая функция: проба Квика-Пытеля, длительность гексеналового сна, активность микросомальных оксигеназ (по деметилированию амидопирина, гидроксилированию анилина, по динамике выделения с мочой метаболитов амидопирина, содержанию цитохрома Р-450). Экскреторная функция: бромсульфалеиновая проба. Углеводная функция: уровень сахара в крови, характер гликемических кривых при нагрузке галактозой, содержание гликогена в печени. Белковая функция: количество общего белка и соотношение белковых фракций в сыворотке крови. Функциональное состояние печени можно также охарактеризовать по активности следующих ферментов в печени и сыворотке крови: аминотрансфераз, сорбитдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатазы, уракениназы, щелочной фосфатазы, изофермента , холинэстеразы.

Для оценки функционального состояния почек определяют суточный диурез, хлориды в моче, клиренс мочевины и креатинина.

О функциональном состоянии симпатоадреналовой системы и обмене серотонина судят по экскреции с мочой адреналина, норадреналина, дофамина, ДОФА ванилин-миндальной кислоты (метаболита катехолтиаминов) и 5-ОИУК (метаболита серотонина).

Для оценки функционального состояния щитовидной железы наиболее адекватным считается проведение пробы с радиоактивным иодом; функции коры надпочечников - определение в моче содержания 17-кетостероидов, 17-оксикортикостероидов, в крови - 11-оксикортикостероидов.

О состоянии окислительных процессов судят на основании результатов потребления кислорода, активности цитохромоксидазы, сукцинат-, лактат-, малат-, дегидрогеназ, пероксидазы, каталазы, содержания окислительных и восстановительных форм никотинамидных коферментов, глютатиона, уровня молочной и пировиноградной кислот, уровня окси-, карбокси- и метгемоглобина.

Специфические показатели характерны для веществ определенного химического строения. Так, при действии ФОС наиболее специфическим является снижение активности ацетилхолинэстеразы в мозгу и эритроцитах, а также холинэстеразы в сыворотке и тканях. Для ряда веществ этой группы характерно также отдаленное нейротоксическое действие. Хлорорганические соединения - яды политропного действия, они оказывают выраженное действие на печень.

Некоторые производные карбаминовой кислоты являются ингибиторами ацетилхолинэстеразы и холинэстеразы, производные дитиокарбаминовой - вызывают нарушения состояния щитовидной железы, дитиокарбаматы и фенилкарбаматы - ряд характерных изменений состава крови (эритропения, лейкопения и др.).

Производные анилина являются метгемоглобинообразователями. Для производных мочевины характерно преимущественное действие на щитовидную железу. Динитрофенольные соединения нарушают процессы окислительного фосфорилирования. Медьсодержащие препараты обладают выраженным гемолитическим и капилляротоксическим действием.

Пестициды, содержащие металлы (ртуть, мышьяк, медь и др.) снижают содержание SН-групп в биосубстратах, для ртутьсодержащих препаратов характерно поражение почек и центральной нервной системы. Производные кумарина являются выраженными антикоагулянтами. Дипиридиловые соединения избирательно поражают легкие.

По окончании эксперимента определяют относительные коэффициенты массы внутренних органов, проводят патоморфологические и гистохимические исследования.

При выборе тестов следует учитывать путь поступления вещества: одно и то же вещество, поступая в организм через рот, может оказывать более выраженное влияние на печень, а через дыхательные пути - на легкие.

Наиболее распространенные методы, используемые в токсикологических исследованиях, описаны в ряде руководств: Рылова М.Л. Методы исследования хронического действия вредных факторов среды в эксперименте (1964); Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (1970); Саноцкий И.В., Уланова И.И. Критерии вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений (1975); Приложение к приказу Министра здравоохранения СССР N 290 от 11 апреля 1972 г. "Об унификации клинических лабораторных исследований" (1974); Шицкова А.П. и соавт. Методы гигиенической и токсикологической оценки биологического действия пестицидов (1977) и др.

Полученные результаты следует сравнить с показателями функционального состояния организма животных контрольной группы и принятыми, физиологическими нормами, которые приведены в монографиях И.П.Западнюка и соавт. Лабораторные животные. Разведение и содержание, использование в эксперименте (1974); И.М.Трахтенберга и соавт. Показатели нормы у лабораторных животных в токсикологическом эксперименте (1978).

Все изменения состояния животных подробно протоколируют и обрабатывают статистически. Выбор методов обработки зависит от поставленных задач. Можно использовать выборочный метод вариационной статистики, разностный метод, методы корреляции, условных вероятностей, дисперсионного анализа и другие методы планирования и оценки результатов эксперимента. Описание этих методов можно найти у И.А.Ойвина (1959), Л.С.Каминского (1964), Д.Сепетлиева (1968), Г.Г.Горовенко и соавт. (1970), Л.Ластеда (1971), В.В.Налимова, Н.А.Черновой (1965) и др.

Порог вредного действия (минимальные дозы либо концентрации, вызывающие изменения биологических показателей, выходящие за пределы приспособительных физиологических реакций) устанавливают по лимитирующему показателю. При установлении пороговых доз и концентраций следует также принимать во внимание динамику изменений, биохимико-морфологические параллели, а также результаты нагрузочных проб.

Для установления вероятностных порогов в последнее время предлагаются различные методические подходы, которые можно разделить на две группы. Методы первой группы обосновывают возможность и целесообразность перевода градированных показателей эффекта в альтернативные по возможности с учетом биологической значимости сдвига (критерия вредности). Методы второй группы связаны с непосредственным расчетом и ее доверительных границ по результатам изменения градированных эффектов и их доверительных границ.

Предлагается два варианта вероятностных определений пороговых доз и концентраций путем перевода градированных показателей в альтернативные с учетом критерия вредности. Первый возможен в том случае, когда известен условный сдвиг, который может рассматриваться как неблагоприятный. Так, понижение активности ацетилхолинэстеразы эритроцитов и холинэстеразы сыворотки крови на 25% и более рассматривается при действии ФОП как значимый неблагоприятный эффект. По этому критерию работающих с ФОП временно отстраняют от работы. Это дает основание при определении порога вредного действия новых ФОП в опытах на лабораторных животных принимать такое снижение за проявление вредного действия и переводить градированный показатель в альтернативный. По результатам эксперимента на животных составляется таблица зависимости доза - ответ, в которой отмечается, у скольких из взятых в опыт животных при воздействии данной дозы наблюдается падение активности фермента на 25% и более. Данные подвергают пробит-анализу для определения эффективной дозы (т.е. дозы, вызывающей у 50% подопытных животных сдвиг, рассматриваемый как неблагоприятный), стандартной ошибки и доверительных границ с учетом малой выборки. Такая обработка позволяет определить пороговые дозы или концентрации с учетом критерия вредности и принятого уровня вероятности наступления учитываемого сдвига. Аналогичный подход возможен и при оценке других биохимических и функциональных изменений в тех случаях, когда можно судить о биохимической значимости этих сдвигов. Важное значение для определения последней имеет оценка биохимико-морфологических параллелей. Если биохимические сдвиги сопровождаются длительными изменениями функции и при этом имеются необратимые структурные изменения, такие изменения следует считать вредными.