ГОСТ Р 54496-2011 (ИСО 8692:2004) Вода. Определение токсичности с использованием зеленых пресноводных одноклеточных водорослей

Приложение ДБ
(обязательное)

     
Методы культивирования водорослей

ДБ.1 Культивирование водорослей для методов А и В

ДБ.1.1 Культивирование водорослей Chlorella vulgaruis Beijer и Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb проводят в конических колбах вместимостью 250 см на питательной среде Прата [см. ДА.1.2 (приложение ДА)] в условиях по 5.4.3.3.

ДБ.1.2 Обновление культуры водорослей

Периодически в процессе культивирования обновляют культуру водорослей, пересевая ее на свежую питательную среду Прата не реже одного раза в 7 сут.

Обновление культуры водорослей проводят следующим способом: в стерильную колбу вместимостью 250 см со свежей питательной средой объемом 150 см над пламенем спиртовки вносят 15-20 см верхнего ростового слоя маточной культуры (содержимое маточной культуры при этом не перемешивают). Затем колбу закрывают стерильной ватно-марлевой пробкой и бумажным колпачком, перемешивают и выдерживают в условиях по 5.4.3.3 (метод А) или по 6.4.1 (метод Б). В процессе культивирования культуру водорослей в колбе периодически перемешивают, встряхивая один-два раза в сутки.

ДБ.1.3 Подготовка водорослей к тестированию

ДБ.1.3.1 Для тестирования культуру водорослей готовят в экспоненциальной фазе роста с заданной плотностью (численностью) клеток следующим способом: за 3 сут до начала тестирования в колбу вместимостью 250 см над пламенем спиртовки добавляют 100 см питательной среды Прата, вносят, не перемешивая, 20 см верхнего ростового слоя водорослей из маточной культуры после культивирования в течение 7 сут (плотность 4·10-5,0·10 клеток/см). Затем колбу закрывают ватно-марлевой пробкой и колпачком, содержимое перемешивают и выдерживают в условиях по 5.4.3.3 в течение 3 сут. При этом культуру водорослей в колбе периодически перемешивают, встряхивая один-два раза в сутки.

ДБ.1.3.2 Через 3 сут, непосредственно перед тестированием определяют плотность (численность) клеток водорослей в полученной культуре одним из методов, приведенных в приложении ДВ, и рассчитывают объем суспензии водорослей, необходимый для внесения в каждую колбу при тестировании.

При использовании прибора для подсчета плотности (численности) клеток водорослей полученное значение интенсивности флуоресценции в отн. ед. умножают на коэффициент пересчета (см. 7.3.5.3) и получают соответствующую этому значению плотность (численность) клеток [см. ДВ.2 (приложение ДВ)].

ДБ.2 Культивирование водорослей для метода Б

ДБ.2.1. Культивирование водорослей Desmodesmus subspicatus Chodat или Pseudokirchneriella subcapitata (Korshikov) Hindak проводят в конических колбах вместимостью 250 см на питательной среде, приготовленной по ДА.2.2 (приложение ДА) в условиях по 6.4.1.

ДБ.2.2 Обновление культуры водорослей - по ДБ.1.2.

ДБ.2.3 Подготовка водорослей к тестированию

ДБ.2.3.1 Для тестирования культуру водорослей готовят в экспоненциальной фазе роста с достаточно низкой плотностью (численностью) клеток водорослей (например, от 5·10 до 10 клеток/см) следующим способом: за 2-4 сут до начала тестирования в колбу вместимостью 250 см над пламенем спиртовки вносят 100 см питательной среды [см. ДА.2.2 (приложение ДА)], добавляют, не перемешивая, необходимое количество суспензии водорослей из маточной культуры после культивирования (см. ДБ.2.1), для того чтобы получить начальную плотность (численность) клеток водорослей примерно от 5·10 до 10 клеток/см. Затем колбу закрывают ватно-марлевой пробкой и колпачком, содержимое перемешивают и выдерживают в условиях по 6.4.1 в течение 3 сут.

ДБ.2.3.2 Определение плотности (численности) клеток водорослей - по ДБ.1.3.2.

ДБ.3 Адаптация культуры водорослей к минерализации от 3 до 6 г/дм

ДБ.3.1 Адаптацию культуры водорослей к минерализации исследуемого объекта от 3 до 6 г/дм проводят заранее к питательной среде с минерализацией 5 г/дм и содержат ее в заданных условиях для культивирования.

Питательную среду с минерализацией 5 г/дм готовят на искусственной морской воде по ГОСТ Р 53910.

ДБ.3.2 Адаптацию водорослей проводят в течение 20 сут, постепенно заменяя в культуре водорослей питательную среду по ДА.1 на питательную среду с минерализацией 5 г/дм.

ДБ.3.3 Через каждые 5 сут меняют соотношение адаптируемой культуры водорослей и питательной среды с минерализацией 5 г/дм в последовательности:

ДБ.3.3.1 В стерильную колбу вместимостью 250 см над пламенем спиртовки вносят 80 см суспензии водорослей в экспоненциальной фазе роста (в возрасте 3 сут) и добавляют 20 см питательной среды с минерализацией 5 г/дм. Культивируют водоросли в течение 5 сут в условиях по 5.4.3.3 - для методов А и В, в условиях по 6.4.1 - для метода Б. При этом общий объем (адаптируемая культура водорослей и питательная среда) должен составлять 100 см.

ДБ.3.3.2 В стерильную колбу вместимостью 250 см над пламенем спиртовки вносят 60 см адаптированной по ДБ.3.3.1 культуры водорослей, добавляют 40 см питательной среды с минерализацией 5 г/дм и культивируют водоросли в условиях по ДБ.3.3.1.

ДБ.3.3.3 В стерильную колбу вместимостью 250 см над пламенем спиртовки вносят 40 см адаптированной по ДБ.3.3.2 культуры водорослей, добавляют 60 см питательной среды с минерализацией 5 г/дм и культивируют водоросли в условиях по ДБ.3.3.1.

ДБ.3.3.4 В стерильную колбу вместимостью 250 см над пламенем спиртовки вносят 20 см адаптированной по ДБ.3.3.3 культуры водорослей, добавляют 80 см питательной среды с минерализацией 5 г/дм и культивируют водоросли в условиях по ДБ.3.3.1.

ДБ.3.2* Адаптированную по ДБ.3.3.4 культуру водорослей пересевают на свежеприготовленную питательную среду (см. ДБ.3.1) и культивируют в течение 5 сут в условиях по 5.4.3.3 - для методов А и В, по 6.4.1 - для метода Б, после чего проверяют физиологическую чувствительность адаптированной культуры водорослей в соответствии с требованиями 5.3.5.

_______________

* Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.