ГОСТ Р ИСО 7405-2011 Стоматология. Оценка биологической совместимости медицинских изделий, применяемых в стоматологии

     6.2 Испытание диффузией в агар

6.2.1 Цель

Данное испытание предназначено для демонстрации неспецифичной цитотоксичности испытуемых материалов после диффузии через агар или агарозу. Данный метод испытания не применим для вымываемых веществ, которые не диффундируют через агар или агарозу.

6.2.2 Клеточная линия

Используют установившуюся клеточную линию фибробластов или эпителия, являющуюся общедоступной [например, из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), см. http://www.atcc.org]. Обозначают в отчете идентификационный номер клеточной линии, если применимо, описание и назначение использованной клеточной линии и обоснование ее выбора.

_______________

Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой означенного изделия со стороны ИСО. Возможно использование эквивалентных продуктов, если доказано, что они приведут к тем же результатам.

6.2.3 Культуральная среда, реагенты и оборудование

Используют культуральную среду, указанную для выбранной клеточной линии. Стерилизуют фильтрацией. Для приготовления агара готовят двойную концентрацию культуральной среды. Стерилизуют фильтрацией. Готовят либо 3%-ный агар, либо 3%-ную агарозу. Стерилизуют автоклавированием.

Готовят витальный краситель разведением основного раствора 1%-ного водного раствора нейтрального красного (регистрируют источник) 1:100 посредством 0,01 моль/л 100 мл фосфатно-буферных физрастворов [например, фосфатно-буферного физраствора Dulbecco] немедленно перед использованием. Хранят растворы нейтрального красного в темном месте. Используют 6-луночные планшетки для культуры тканей (диаметром 35 мм) или чашки Петри номинальным диаметром от 50 до 100 мм, пригодные для культуры тканей.

_______________

Dulbecco является торговым наименованием. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой означенного изделия со стороны ИСО. Возможно использование эквивалентных продуктов, если доказано, что они приведут к тем же результатам.

6.2.4 Приготовление проб

Готовят пробы в соответствии с 6.1. Исследование проводят на экстракте материала и/или самом материале, согласно руководству в ИСО 10993-5.

a) Для твердых материалов готовят круглые испытуемые пробы диаметром примерно 5 мм с плоской поверхностью для обеспечения адекватного контакта с верхним слоем агара.

b) Для застывающих материалов вводят свежесмешанный материал в кольца внутренним диаметром 5 мм и высотой 2 мм. Материал кольца должен быть указан в отчете об исследовании. При испытании материалов в свежесмешанном состоянии помещают кольца на агар до введения материала. При испытании после различных периодов застывания наполняют кольца так, чтобы материал находился вровень с кромкой, и дают ему застыть при температуре (37±2) °С и относительной влажности (90±10)% до готовности для испытания.

c) Для жидких используемых проб или экстрактов впитывают 0,01 мл жидкости в боросиликатный тонкостекольный фильтровый диск диаметром 5 мм, помещенный на агар.

Примечания

1 Подходящими инертными материалами являются стекло или PTFE.

2 Подходящие диски могут быть приготовлены из предфильтров.

6.2.5 Контрольные образцы

Используют положительные контрольные образцы, отрицательные контрольные образцы и эталонные материалы.

6.2.6 Процедура испытания

Культивируют клетки, пока они не достигнут конца фазы логарифмического роста. Пипетируют надлежащий объем (например, 10 мл для 100-миллиметровой чашки Петри) клеточной суспензии (2,5x10 клетки/мл) в достаточное число чашек Петри и инкубируют при температуре (37±2) °С в водонасыщенной атмосфере с 5% (объемная доля) углекислого газа в течение 24 ч. Если используют другие условия культивирования клеток, необходимо предоставить обоснование.

Нагревают стерильный агар или агарозу до температуры 100 °С на водяной бане и дают остыть до температуры 48 °С.

Смешивают одну часть агара или агарозы с одной частью свежеприготовленной культуральной среды двойной концентрации и нагревают до температуры 48 °С. Аспирируют жидкую культуральную среду из каждой чашки Петри и заменяют 10 мл свежеприготовленной смесью агара или агарозы и культуральной среды.

Дают смеси агара или агарозы и культуральной среды затвердеть при комнатной температуре (примерно 30 мин). Добавляют 10 мл раствора нейтрального красного и держат в темноте от 15 до 20 мин. Аспирируют избыточный раствор нейтрального красного. Защищают культуру от света в присутствии нейтрального красного, так как клетки могут быть повреждены.

Вносят в каждую чашку необходимое число проб испытуемого материала и контрольных образцов с адекватным расстоянием (больше 20 мм) между соседними пробами, если применимо. Инкубируют при температуре (37±2) °С в водонасыщенной атмосфере с 5% (объемная доля) углекислого газа в течение 24 ч. Осматривают каждый испытуемый материал, по меньшей мере, четыре раза (т.е., две чашки на испытуемый материал).