Р 4.2.2643-10 Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности

Приложение 2
рекомендуемое

Методики приготовления питательных сред для культивирования тест-микобактерий, предназначенных для изучения и оценки туберкулоцидной активности ДС и их субстанций

Методика приготовления среды Петраньяни

1. В рецептуру питательной среды входят следующие компоненты:

2. В стерильную колбу (1 л) помещают 12 г крахмала и 2 г пептона. Затем добавляют 2 шт. мелко нарезанного картофеля (картофель предварительно моют с мылом и щеткой, чистят). Доливают в колбу 300 мл свежего цельного молока и подогревают на водяной бане в течение часа (с момента начала свертывания молока) при постоянном помешивании. В другую стерильную колбу разбивают 8 диетических яиц и 2 желтка. Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла, затем оставляют на 30 мин в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70%-й этиловый спирт на 30 мин. Перед тем, как начать работу с чистыми и сухими яйцами, рекомендуется тщательно вымыть руки с мылом и щеткой. Яйца тщательно взбивают до однородной массы и переливают в колбу со смесью крахмала, пептона, картофеля и молока. Сюда же добавляют 24 мл глицерина и 16 мл 2%-го раствора малахитовой зелени. Полученную смесь тщательно перемешивают, фильтруют через стерильный марлевый фильтр в стерильную колбу. Для свертывания среды используют специальные аппараты-свертыватели типа "АСПС". Пробирки с разлитой в них средой помещают в специальные штативы с подобранным углом наклона для формирования скошенной поверхности среды высотой 8-10 см. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 85 °С в течение 45 мин.

3. Приготовление раствора малахитового зеленого:

Взвешенный порошок малахитового зеленого растворяют в стерильной теплой дистиллированной воде и помещают раствор в термостат на 1-2-2,5 ч для большего растворения. Затем фильтруют раствор через бумажный фильтр, разливают по флаконам или небольшим колбам и стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (121 °С) в течение 30 мин. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению, и при появлении осадка или изменении окраски его заменяют свежим раствором.

Методика приготовления картофельно-глицеринового бульона

Готовят картофельный отвар. На 1 л питьевой воды берут 200 г очищенного (картофель предварительно моют с мылом и щеткой, чистят) картофеля, отваривают в течение 30 мин с момента закипания, остужают и отстаивают. Затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр и доводят водой до первоначального объема, добавляют 10 мл глицерина. рН картофельного бульона 7,0-7,2. Бульон стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (121 °С) в течение 30 мин.

Методика приготовления картофельно-глицеринового агара

В рецептуру питательной среды входят следующие компоненты:

К картофельно-глицериновому бульону добавляют 5 г пептона, 20 г агар-агара, 1 г мела, устанавливают рН 7,0-7,2. Агар расплавляют и разливают в пробирки или колбы. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (121 °С) в течение 30 мин.

Методика приготовления среды Миддлбрука 7Н9 бульон с 10%-ми ростовой добавки ADC (MADC-бульон для хранения замороженных культур при минус 70 °С)

Ингредиенты соединить, перемешать, стерилизовать в паровом стерилизаторе при 1,1 атм. (121 °С) в течение 10 мин, охладить до 45 °С. Добавить в асептических условиях 100 мл ростовой добавки ADC и стерильной дистиллированной воды до 1000,0 мл.

рН среды будет эквивалентен 6,6±0,2 в бульоне, остывшем до 25 °С.

Методика приготовления среды Левенштейна-Йенсена

Среда Левенштейна-Йенсена - международная среда, широко используемая в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности.

Это плотная яичная среда, на которой видимый рост М. terrae получают приблизительно на 7-10-й день после посева. Для чистоты эксперимента желательно использовать готовую питательную среду в стандартных пробирках с завинчивающимися крышками. При невозможности приобретения готовой среды ее можно приготовить самостоятельно.