МУ 4.2.2723-10 Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды

     11.3. Определение Н-антигена выделенных микроорганизмов

Для определения Н-антигенов используют ту же культуру, выросшую на питательном агаре. Если культура малоподвижна, можно применять полужидкий (0,7%) агар, условно называемый агаром для роения, формируя посев в виде небольшого пятна в центре чашки Петри. Посев инкубируют в течение ночи при 37 °С. Сухие сальмонеллезные Н-сыворотки растворяются также как и О-сыворотки, согласно прилагаемой инструкции. На предметное стекло наносят одну каплю Н-сыворотки и одну каплю изотонического раствора хлорида натрия. С периферии указанного агара для роения или из конденсата на косяке берут полную петлю культуры. Наносят ее на предметное стекло вблизи капли изотонического раствора хлорида натрия и эмульгируют (контроль на отсутствие спонтанной агглютинации). При отсутствии спонтанной агглютинации манипуляцию повторить в капле Н-сыворотки, формируя равномерную непрозрачную суспензию. Учет результатов проводят в течение 1-2 минут, мягко покачивая стекло. Гомогенная суспензия свидетельствует об отрицательном результате. Образование хлопьев (зерен) агглютината внутри капли расценивается как положительный результат.

Результаты определения О- и Н-антигенов сальмонелл фиксируются в протоколе. В случае отсутствия реакции агглютинации с сыворотками одной из Н-фаз проводят инверсию (подавление) обнаруженной Н-фазы (метод Свена-Гарда).

Для определения невыявленного Н-антигена готовят чашки Петри с полужидким (0,7%) агаром. После застывания агара в центр чашки добавляют 0,1 мл аитисыворотки против выявленного Н-антигена первой или второй фазы. Дают сыворотке впитаться в агар, а затем в центр капли петлей наносят культуру.

Вместо чашки можно также использовать U-образную трубку. Инкубировать посев при 37 °С 18-24 часа (чашки не переворачивать!). Соответствующая антисыворотка связывает выявленный Н-антиген, подвижность (роение) штамма будет происходить за счет клеток, содержащих Н-антиген не обнаруживаемой фазы. Неизвестная фаза Н-антигена определяется тем же способом, что и выявленная. При этом культура берется с периферии выросшей макроколонии или с противоположного относительно посеву колена U-образной трубки. Затем после суммирования результатов О и Н-серотипирования определяется серовар штамма, согласно схемы Кауфмана-Уайта.

Серологическую идентификацию сальмонелл начинают с испытания их в реакции агглютинации на стекле с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сывороткой к сальмонеллам групп А, В, С, Д, Е, а в случае получения отрицательного результата с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сывороткой к сальмонеллам редких групп.

При получении положительных результатов агглютинации со смесью О-сывороток, культуру испытывают с каждой О-сывороткой, входящей в смесь. После установления принадлежности культуры к одной из О-групп, выявляют наличие дополнительных О-антигенов, присущих представителям указанной группы.

После этого проводят реакцию агглютинации с Н-сыворотками. При этом вначале используют Н-сыворотки, соответствующие Н-антигенам 1 фазы, а потом Н-антигенам 2 фазы. Начинать следует с Н-сывороток, соответствующих более распространенным сероварам данной группы.

Для реакции агглютинации с О-сывороткой следует брать культуру с верхней части скошенного агара, для Н-сывороток - конденсат или с нижнего участка роста (наиболее подвижные особи).

Для подтверждения принадлежности культуры к роду Salmonella, в случае затруднений с идентификацией, можно пользоваться пробой с бактериофагом, используя лечебный бактериофаг сальмонеллезный.

Для этого две капли четырех- или восемнадцатичасовой бульонной культуры испытуемого штамма наносят тонко оттянутой пастеровской пипеткой или петлей на хорошо подсушенный слабощелочной агар в чашке Петри. После подсыхания на одну из капель петлей или пастеровской пипеткой меньшего диаметра, наносят каплю бактериофага, а на другую, в качестве контроля - каплю бульона.

На одной чашке, таким образом, можно испытать одновременно 5-6 культур.

Чашки с нанесенными культурами и бактериофагом помещают в термостат на 18-24 часа, после чего учитывают результаты по появившейся на месте нанесения фага четко очерченной зоне сливного лизиса или большего или меньшего числа негативных колоний.

При отсутствии лизиса в местах нанесения фага будет сплошной рост культуры, как в контроле.

Атипичные сальмонеллезные культуры в большинстве случаев чувствительны к фагу, в то время как штаммы представителей других родов семейства Enterobacteriaceae, как правило, не лизируются этим фагом.