Статус документа

МУ 1.2.2634-10 Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза

4.8.2. Проведение количественного посева

Посев из соответствующих разведений суспензии производится строго количественно - по 0,05 см на различные плотные питательные среды с последующим распределением материала с помощью шпателя или бактериологической петли по всей поверхности агаризованной среды в чашке Петри (допускается посев мерного количества на или часть чашки Петри). В жидкие и полужидкие питательные среды вносят по 1 см суспензии. Схема первичного посева, питательные среды, сроки и условия инкубации приведены в табл.1.

Таблица 1

Схема первичного посева суспензии фекалий (содержимого слепой кишки) животных


Микроорганизмы: группа, семейство, род, вид	Питательные среды	Разведения исследуемого материала	Сроки, условия инкубации
1	2	3	4
Общее число анаэробных микроорганизмов	Кровяной агар, 6-10%	10, 10, 10, 10	До 7 суток в анаэробных условиях при ежедневном контроле роста
Общее число аэробных микроорганизмов	Кровяной агар 3%	10, 10, 10	48 ч в аэробных условиях
Лактобациллы	Модифицированный агар Рогозы (МРС)	10, 10, 10	3 суток в микроаэрофильных условиях
Стрептококки	Кровяной агар 3%	10, 10, 10	48 ч в аэробных условиях
Бактероиды	Кровяной агаре неомицином 6%	10, 10, 10	48 ч в анаэробных условиях или в аэробных условиях с применением часовых стекол
Бифидобактерии	Тиогликолевая среда или среда Блаурокка	10-10	3-5 суток в анаэробных или микроаэрофильных условиях
Энтеробактерии	Эндо	10, 10, 10	24 ч в аэробных условиях
	Цитратный агар	10, 10, 10	4 суток в аэробных условиях
Энтерококки	Молочно-солевой агар с полимиксином (МИС)	10, 10, 10	48 ч в аэробных условиях
Патогенные микроорганизмы: шигеллы, сальмонеллы	Висмутсульфитагар, среда Плоскирева	10	24-48 ч в аэробных условиях
Бактерии рода протея	Эндо, Цитратный агар		24 ч 4 суток
Стафилококки	Желточно-солевой агар Среда Байрд-Паркера	10, 10, 10	48 ч в аэробных условиях
Сульфитредуцирующие клостридии*	Железосульфитная среда	10-10	5 суток в анаэробных или микроаэрофильных условиях
Дрожжевые грибы, плесени	Среда Сабуро	10, 10	3-5 суток в аэробных условиях
* при учете клостридий следует иметь в виду, что почернение среды может быть связано с присутствием сульфитредуцирующих энтеробактерий.

Общее число анаэробных и аэробных микроорганизмов учитывают на 6-10%-ном кровяном агаре, инкубируемом в анаэробных условиях (в атмосфере углекислого газа 5-10%) и в аэробных условиях для сопоставления выросших колоний. Инкубация при 37 °С 48 ч.

Количество бактероидов определяют с использованием часовых стекол. Из соответствующих разведений исследуемого материала наносят автоматической пипеткой по 0,05 см на чашки Петри на кровяной агар с неомицином для бактероидов. После того, как капля "втягивется" в агар, на место посева накладывают часовые стекла с агаром, на который посеяна культура Serratia marcencens. Рост этого строго аэроба обеспечивает создание анаэробных условий, необходимых для культивирования бесспоровых анаэробных бактерий.

Подготовка часовых стекол.

В часовые стекла заливают 1,0-2,0 см кровяного агара с неомицином, подсушивают в течение 20 мин в термостате при температуре 37 °С. Суточную культуру Serratia marcescens, выращенную на скошенном мясо-пептонном агаре, смывают 10 см стерильной дистиллированной воды, взбалтывают и выливают в чашку Петри. Затем стерильным ватным тампоном наносят суспензию на поверхность агара в часовых стеклах. После 4 ч инкубации при 37 °С обработанные таким образом часовые стекла накладывают на поверхность питательной среды, предназначенной для культивирования бактероидов. После инкубации в течение 48 ч выросшие колонии микроскопируют и подсчитывают. Колонии бактероидов - плоские голубоватого цвета с матовой поверхностью, с ровными или зазубренными краями, как правило, колонии мелкие.

Для остальных представителей микробиоценоза применяют следующие условия культивации:

бифидобактерии определяют на тиогликолевой среде или на среде Блаурокка с последующим определением рН в среде культивирования;

лактобациллы - на среде МРС;

энтеробактерии - на среде Эндо и цитратном агаре;

бактерии рода Proteus - на средах, используемых для учета энтеробактерий;

содержание стафилококков определяют на желточно-солевом агаре и агаре типа Байрд-Паркер, с последующим определением плазмокоагулирующей активности;

стрептококки - на кровяном агаре;

энтерококки - на среде МИС;

количество сульфитредуцирующих клостридий - на железо-сульфитной среде;

количество дрожжеподобных грибов - на среде Сабуро с дальнейшим определением характера филаментации и наличия хламидоспор на рисовом агаре.

Гемолитические свойства энтеробактерий, стафилококков, энтерококков изучают на кровяном агаре.

Морфологию выделенных культур определяют микроскопированием окрашенных по Грамму мазков-препаратов.

У штаммов энтеробактерий проводят определение таксономической принадлежности до вида с использованием систем для биохимической идентификации энтеробактерий (Api 10S, Api 20E, RapiD 20E и др.) или посевом на диагностические среды для определения способности к ферментации углеводов (среды Гисса, трехсахарный агар) и аминокислот (фенилаланин-агар, среды с лизином, орнитином, аргинином).