МУ 3.5.2596-10 Методы изучения и оценки туберкулоцидной активности дезинфицирующих средств

3.2. Получение и хранение исходной рабочей культуры тест-микобактерий

Для выращивания культур тест-микобактерий используют плотные питательные среды. Перечень и методика приготовления питательных сред для культивирования тест-микобактерий, предназначенных для изучения и оценки туберкулоцидной активности ДС и их субстанций, приведены в прилож.2. В отличие от питательных сред, рекомендуемых в стандарте NEN-EN 14476*, использование приведенных в приложении питательных сред позволяет получать результат оценки туберкулоцидной активности ДС не на 21, а на 10-14 сутки.

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Для получения культуры штамма тест-микобактерий ампулу с лиофилизированной музейной культурой этого штамма вскрывают в асептических условиях следующим образом: ватным тампоном, смоченным 70% этиловым спиртом, обрабатывают поверхность ампулы, затем нагревают ее запаянный конец в пламени горелки до образования на ампуле трещины. К накаленному концу ампулы прикладывают ватную пробку, смоченную стерильной водой. После этого ударом металлического инструмента (скальпель, пинцет) по трещине откалывают конец ампулы. Стерильной пастеровской пипеткой в ампулу вливают 1,0 мл стерильной дистиллированной воды и оставляют в течение 30 мин при комнатной температуре для растворения лиофилизата и получения суспензии. Суспензию, приготовленную из музейной тест-культуры, рассевают по 0,1 мл в пробирки со скошенной питательной средой Левенштейна-Йенсена или "Новая" (всего 10 пробирок). Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 5-7 суток.

С выросшими на питательных средах культурами М. terrae далее работают следующим образом:

полученную биомассу снимают платиновой лопаточкой или стеклянной палочкой с поверхности питательной среды Левенштейна-Йенсена или "Новая" со всех пробирок;

помещают в пробирку с 10 мл бульона Миддлбрука 7Н9 с 10% ADC ростовой добавкой и гомогенизируют;

доводят объем полученной суспензии до 100 мл бульоном Миддлбрука 7Н9 и по 0,5 мл суспензии вносят в микропробирки;

подписывают на каждой пробирке наименование штамма и дату;

замораживают при -70°С и оставляют в таком состоянии для длительного хранения.

Это самый эффективный способ длительного (десятилетиями) хранения культур с обеспечением сохранения биологических свойств тест-микобактерий. При отсутствии такой возможности суспензию в микропробирках замораживают в бытовом холодильнике при -20°С. Срок хранения культуры в таких условиях - не более 5 лет.

Данная методика получения и хранения исходной рабочей культуры тест-микобактерий позволяет длительный период времени проводить испытания ДС с максимальным обеспечением стандартности свойств тест-микобактерий, в т.ч. по устойчивости к различным факторам, поскольку исключает необходимость многократного пересева, приводящего, как известно, к изменению биологических свойств микроорганизмов.

Полученная и хранящаяся таким образом культура тест-микобактерий используется для получения агаровой культуры тест-микобактерий (первый пассаж) и приготовления из нее рабочей суспензии тест-микобактерий, используемой для проведения испытаний ДС.