МУК 4.2.2495-09 Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам

5.8. Диско-диффузионный метод

Проверенный на пригодность с использованием эталонных антибиотикочувствительных штаммов питательный агар (приготовленный, расплавленный, остуженный, как указано ранее) разливают в чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности, в объеме 20 мл на чашку диаметром 90 мм, 25 мл - на чашку диаметром 100 мм, 60 мл - на чашку диаметром 150 мм. Толщина слоя агара должна составлять строго (4±0,5) мм. Эти требования следует выполнять обязательно, т.к. зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя.

Перед использованием свежеприготовленных чашек или после хранения в холодильнике (7-10 сут в запаянных полиэтиленовых пакетах) их необходимо подсушить при 37 °С (в течение 15 мин).

При определении чувствительности культур микроорганизмов с помощью ДДМ необходимо использовать только стандартизированные качественные диски производственного изготовления.

Каждую серию дисков с АПБ контролируют с помощью референс-штаммов на соответствие заявленным концентрациям на питательной среде, прошедшей контроль качества. Диски, дающие диаметры зон ингибиции роста большие, чем допустимый диапазон значений для референс-культуры, выбраковываются, т.к. их использование может привести к отнесению антибиотикорезистентных штаммов к разряду чувствительных.

Проверенные на пригодность серии дисков с АПБ хранятся до истечения срока годности в герметичной упаковке при -18 °С и ниже. Используемые в работе диски можно хранить в холодильнике (4-8 °С). Картриджи должны быть плотно упакованными, чтобы не допустить попадания в них влаги. Флаконы с дисками (картриджи) следует извлекать из холодильника за 1 ч до начала работы и открывать только по достижении ими комнатной температуры, предотвращая тем самым образование конденсата влаги на дисках после открывания картриджа.

Бактериальную суспензию необходимой концентрации наносят на агаровую чашку Петри в объеме 0,2-0,3 мл и распределяют равномерно по поверхности с помощью стерильного шпателя. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин и затем наносят диски (не более 6 на чашку). Диски наносят стерильным пинцетом и слегка придавливают. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно составлять 15-20 мм.

Чашки с посевом без дисков (контроль роста культуры) и с дисками инкубируют вверх дном 18-48 ч при температуре, оптимальной для роста изучаемого вида возбудителя (28, 37 °С). Параллельно с тестируемыми культурами необходимо проводить внутренний контроль качества исследования - определение чувствительности референс-штамма к используемым АПБ. Учет результатов проводится только при наличии сливного роста культуры на чашках без дисков и соответствия величин зон ингибиции роста контрольных штаммов значениям, приведенным в соответствующих таблицах. Измерение диаметров зон полного подавления видимого роста производят кронциркулем, штангенциркулем, с помощью линейки-лекала (с точностью до 1 мм) на чашках, помещенных кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом 45°.

Появление колоний в зоне задержки роста микроорганизмов может свидетельствовать или о загрязнении культуры посторонней микрофлорой или о гетерогенности тестируемой культуры по признаку чувствительности/устойчивости к данному антибиотику. И в одном, и в другом случае исследование необходимо повторить с изучением чувствительности к АБП культур из колоний (если это не загрязнение), выросших в пределах диаметра зоны ингибиции роста. Интерпретацию результатов исследования следует провести с использованием таблиц, в которых даны пограничные значения диаметров зон ингибиции роста исследуемого микроорганизма конкретным АБП (разделы 6, 7, 8, 9, 10, 11).

В паспорт каждой выделенной культуры необходимо вносить не только значения МПК, диаметров зон задержки роста, но и интерпретацию результатов исследований: штамм чувствительный, промежуточный или устойчивый.