МУК 4.2.2495-09 Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам

5.7. Метод серийных разведений в агаре

Важным этапом МСР является приготовление растворов АБП.

Растворы с высокими концентрациями препаратов (100000-10000-1000 мг/л) являются основными и могут храниться при 2-8 °С в течение недели. Исключением являются растворы тетрациклинов, беталактамов, фуразолидона, сульфаниламидов, которые необходимо использовать ex tempore для внесения в питательные среды в необходимых концентрациях.

Для приготовления основных растворов используют субстанции АБП с известной активностью. При отсутствии субстанций в экстренных случаях допускается использование препаратов в виде мелкодисперсных порошков, инъекционных форм препаратов. АБП взвешивают на электронных лабораторных весах с точностью до 4-го знака. Объем растворителя должен соответствовать количеству активного вещества в навеске. Расчет навески АБП для приготовления основного раствора проводят по формуле:

,

     
где  - расчетная (теоретическая) навеска АПБ, мг;

- необходимая концентрация АПБ, мкг/мл;

- объем растворителя для растворения теоретической навески, мл;

- активность АПБ (количество активного вещества, содержащегося в субстанции), мкг/мг.

Взвесить точно расчетное количество порошка практически невозможно. Поэтому готовят близкую к расчетной навеску, а затем пересчитывают количество необходимого растворителя.

,

     
где - объем растворителя для растворения практической навески, мл;

- полученная навеска АПБ, мг;

- расчетная (теоретическая) навеска АПБ, мг;

- объем растворителя для растворения теоретической навески, мл;

Различия в растворимости АБП определяют необходимость использования растворителей (солюбилизаторов) в минимальном объеме и необходимого количества разбавителя (дистиллированная вода). Для растворения тетрациклинов, рифампицина, фуразолидона используют димексид, левомицетин растворяют в 96°-м спирте. Приготовление основных растворов налидиксовой кислоты и фторхинолонов проводят в от необходимого объема дистиллированной воды добавлением по капле 0,1 М KОН до полного растворения препаратов с последующим доведением растворителя до расчетного объема. Растворителем и разбавителем для других АБП служит дистиллированная вода.

Для измерения объемов растворов антибиотиков используют калиброванные дозаторы и пипетки.

Рабочие растворы АБП готовят на дистиллированной воде в концентрациях, необходимых для внесения в расплавленный и остуженный (до 48-50 °С) агар (20 мл на одну чашку Петри) для создания в нем двукратно увеличивающихся концентраций (например: 1-2-4-8-16-32 мг/л) препарата в соответствии с пограничными значениями МПК для чувствительных и устойчивых штаммов данного вида микроорганизма. В зависимости от необходимого количества чашек Петри с каждой из концентраций АБП используют мерные широкогорлые флаконы на 50-100 мл, в которые наливают агар в объеме 20-40 мл и т.д. и добавляют раствор АБП (начиная с наименьшей концентрации), интенсивно размешивают и выливают в чашки Петри, на которых указана концентрация АБП. Контролем служит агаровая чашка без АБП. После застывания агара в чашках и их подсушивания на дне чашки делают надписи: дата посева, вид возбудителя, номер исследуемых культур.

Испытуемые суспензии культур наносят на поверхность питательного агара без АПБ (контроль) и с АБП (начиная с наименьшей концентрации) каплями легким касанием пипетки (~0,005 мл) или с помощью штампа-репликатора (~0,001 мл). Одновременно можно изучать до 25-50 культур, обязательно включая контрольные референс-штаммы, что обеспечивает достоверность данных антибиотикограммы.

После полного впитывания капель суспензий в агар чашки переворачивают вверх дном и инкубируют при оптимальной для данного возбудителя температуре (28, 37 °С) в течение 18-48 ч. Учет результатов проводят после появления роста тестируемых культур на агаре без АБП и при условии, что значения МПК для контрольных штаммов укладываются в рекомендуемый диапазон значений этого показателя для испытуемых АПБ (таблицы в соответствующих разделах). Минимальная подавляющая концентрация (МПК) - это концентрация АБП в агаре, которая полностью подавляет рост культуры. По значению МПК исследуемая культура может быть отнесена к чувствительной, промежуточной, устойчивой в соответствии с критериями для изучаемого вида возбудителя (таблицы в соответствующих разделах).