МУК 4.2.2315-08 Серологические методы в диагностике холеры. Дополнение к МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная диагностика холеры"

4.2. Определение агглютининов в сыворотке крови

4.2.1. Реакция агглютинации (РА) с живыми культурами

Агглютинины в крови больных холерой обнаруживаются, начиная с 6-9 дня болезни в титрах 1:40-1:80, достигая к 12-16 дню максимальных значений 1:640-1:1280. Диагностическими считаются титры агглютинации в разведении 1:40 и выше или их 4-кратное нарастание в парных сыворотках.

Работу с живыми культурами холерных вибрионов осуществляют с соблюдением требований действующих санитарных правил по безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности).

    Методика постановки реакции агглютинации (РА) в макрообъеме

Исследуемую сыворотку титруют в 1%-й пептонной воде рН 7,5±0,1 в объеме 1 мл от 1:10 до 1:640. В качестве антигена используют 3-часовую бульонную культуру холерного вибриона, выделенного в данном очаге, или сыворотку исследуют в 3-х рядах с 3-часовыми бульонными культурами тест-штаммов холерных вибрионов О1 (сероваров Огава, Инаба) и О139 серогрупп. В пробирки с титрованной сывороткой вносят по 1 капле культуры-антигена и ставят на 1 ч в термостат при 37 °С, затем до утра в холодильник при температуре (4,0±0,5) °С, после чего отмечают результаты. Реакция сопровождается контролями антигена и сыворотки.

При определении титра реакции учитывают разведения с агглютинацией на 3-4 креста.

Методика постановки реакции агглютинации (РА) в микрообъеме

Материалы и оборудование.

Микропланшеты для иммунологических реакций с круглодонными лунками и прозрачными крышками.

Механические 1-, 4- и 8-канальные дозаторы с переменным объемом 50-200 мкл и соответствующие наконечники.

Кюветы (подносы) эмалированные, фаянсовые.

Стереомикроскоп типа МБС-10.

Культура холерного вибриона, выделенная в данном очаге, или тест-штаммы холерных вибрионов О1 (сероваров Огава и Инаба) и О139 серогрупп (допускается использование убитых культур).

Постановка реакции.

Реакция осуществляется в объеме 0,1 мл (100 мкл).

Готовят взвесь культуры (антигена) холерного вибриона, выделенного в данном очаге, или тест-штаммов холерных вибрионов О1 (сероваров Огава и Инаба) и О139 серогрупп в 3-4 мл 0,85%-го раствора хлорида натрия из 6-18-часовой агаровой культуры до концентрации 2х10 м.к. в 1 мл, что соответствует 10 ед. стандарта мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Микропланшеты маркируют, надписывая карандашом с левой стороны номер исследуемой сыворотки, а сверху ее разведения от 1:5 до 1:640, номер штамма (живой или убитой культуры).

В лунки каждого ряда дозаторами разливают по 50 мкл 0,85%-го раствора хлорида натрия. Затем в 1-ю лунку вносят 50 мкл исследуемой сыворотки, инактивированной при 56 °С 30 мин, в разведении 1:5 и проводят двукратное ее разведение микропипеткой на 50 мкл, из последней лунки удаляют 50 мкл. Затем в каждую лунку вносят 50 мкл взвеси культуры-антигена в концентрации 2х10 м.к. в 1 мл. Реакция сопровождается контролями антигена (антигенов) и исследуемой сыворотки. Планшет накрывают крышкой и помещают в термостат при 37 °С на 2 ч.

Учет реакции.

Учет реакции проводят в косо проходящем свете под стереомикроскопом МБС-1, МБС-2 или МБС-10.

Реакцию оценивают по характеру агглютинации на дне лунки:

полная агглютинация: наличие на дне лунки рыхлой разорванной пленки, четких хлопьев на фоне темного поля;

неполная агглютинация: наличие нежной пленки и полиморфных комочков агглютината на темном фоне;

слабая агглютинация: наличие мелких хлопьев на фоне сероватого поля;

следы агглютинации: мелкие единичные хлопья на фоне мутной жидкости.

Реакцию оценивают отрицательно, когда в луночке вибрионы равномерно выстилают дно или собираются в "пуговку". Под микроскопом видно равномерное мелкозернистое поле без темных промежутков.

Положительной считают реакцию при наличии полной и неполной агглютинации.

При постановке реакции агглютинации в микрообъеме дополнительно предусматривают следующее: