Методические указания по определению полиэдров вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда в воде, почве, на растительных объектах и в воздухе иммунофлюоресцентным методом

Подготовка к определению. При отсутствии централизованного изготовления специфических иммунных антиполиэдренных сывороток основная подготовительная работа сводится к приготовлению этих сывороток в лабораторных условиях.

Иммунную антиполиэдренную сыворотку получают путем внутривенной иммунизации кроликов суспензией очищенных полиэдров с титром 1х10 пдр/мл.

Полиэдры извлекают из препарата вирин-ЭНШ следующим образом. Проводят 3-кратный отмыв 100 мл препарата от глицерина физиологическим раствором при 5000 об/мин в течение 20 мин. Затем проводят дифференциальное центрифугирование при 300 об/мин для осаждения крупных частиц тканей насекомых в течение 3 мин. Супернатант осторожно отсасывают пипеткой и центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин для осаждения полиэдров. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и диспергируют на магнитной мешалке 10-15 мин. Дальнейшую очистку ведут в градиенте плотности 20, 30, 40, 50% сахарозы. Чистые полиэдры задерживаются на границе 40% и 50% сахарозы. Отбирают пипеткой этот слой и отмывают полиэдры от сахарозы путем 5-кратного разбавления физиологическим раствором с последующим центрифугированием при 5000 об/мин 30 мин. Отмывание проводят 3 раза. Полученный осадок ресуспендируют в 10 мл физиологическом растворе. Титр определяют в камере Горяева. Рабочее разведение для иммунизации 1·10 пдр/мл.

За сутки до введения животным взвесь полиэдров обрабатывают антибиотиками из расчета 500-1000 ед. пенициллина и стрептомицина, 20 ед. нистатина на 1 мл взвеси.