МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГРАНУЛ ВИРУСА ГРАНУЛЕЗА ЯБЛОННОЙ ПЛОДОЖОРКИ НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ*

________________

* Подготовили В.И.Касьяненко, В.И.Трусов, В.Л.Васильева, А.С.Нещерет (КНИИЭИБ).

УТВЕРЖДЕНО 30.03.81 N 2352-81

Краткая характеристика препарата. Вирин-ГЯП - вирусный энтомопатогенный препарат - вирусный инсектицид. Предназначается для борьбы с гусеницами яблонной плодожорки в яблоневых садах. Действующее начало препарата - вирус гранулеза семейства бакуловирусов, находящийся в препарате в белковых тельцах-включениях сферической формы (гранулах), образующихся в клетках тканей больных вирозом гусениц. Размеры гранул 393,9х207,7 нм. Гранулы содержат одну, реже две вирусные частицы (вирионы). Препарат - водная суспензия гранул с титром не менее 1х10 грн/мл. Применяется путем опрыскивания яблоневых деревьев против гусениц всех возрастов.

Вирин-ГЯП не опасен для позвоночных животных с точки зрения возможной инфекционности или токсичности при однократном или множественном воздействии различных доз препарата. В связи с низкой токсичностью ЛД не определяется. Пероральное введение даже максимальных доз не приводит к гибели животных.

Принцип метода. Метод основан на специфической реакции взаимодействия антигена (гранулы) с антителами, меченными флюоресцирующим красителем (ФИТЦ). Реакция выявляется при наблюдении в люминесцентный микроскоп в виде специфического ярко-зеленого свечения комплекса антиген - антитело ободка гранул.

При условии изготовления качественных иммунных антигранулезных сывороток иммунофлюоресцентный метод является экспресс-методом, высокочувствительным и специфичным.

Метрологическая характеристика метода. Данным методом можно определить от 1·10 до 1·10 гранул в 1 мл субстрата.

Реактивы и материалы. Ацетон. Хлорид натрия (рН 7,1-7,2), 0,85%-ный раствор. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло. Мертиолят. Меченная изотиоционатом флюоресцеина ослиная сыворотка против глобулинов кролика (изготовленная в Институте эпидемиологии и микробиологии им. И.Ф.Гамалеи). Специфическая антигранулезная кроличья сыворотка. Адъювант Фрейнда.

Приборы, аппаратура, посуда. Люминесцентный микроскоп. Окулярная сетка. Объект-микрометр. Центрифуга (до 12 тыс. об/мин). Термостат (37 °С). рН-Метр. Колбы. Пробирки бактериологические. Чашки Петри. Предметные стекла. Пипетки мерные и пастеровские.

Способ приготовления иммунных сывороток в лабораторных условиях. В качестве инъекционного материала используют суспензию очищенных гранул в растворе NaCl с титром не менее 1·10 грн/мл. Гранулы извлекают из препарата вирин-ГЯП следующим образом. Препарат диспергируют на магнитной мешалке в течение 20 мин. Затем проводят дифференциальное центрифугирование при 1,5 тыс. об/мин для осаждения крупных частиц тканей гусениц 15 мин. Супернатант отсасывают пипеткой, размешивают на магнитной мешалке и центрифугируют при 2,5 тыс. об/мин для осаждения микроорганизмов 10 мин. Осаждают гранулы центрифугированием при 12 тыс. об/мин в течение 1 ч. Осадок гранул ресуспендируют в физиологическом растворе и полученную суспензию обрабатывают антибиотиками из расчета 500-1000 ед. пенициллина и стрептомицина на 1 мл взвеси.