МУ 3.5.2.2358-08

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

3.5.2. ДЕЗИНСЕКЦИЯ

Определение уровня чувствительности синантропных насекомых к инсектицидам

     

Дата введения 2008-08-01

1. РАЗРАБОТАНЫ ФГУН НИИ дезинфектологии Роспотребнадзора (С.А.Рославцева, О.Ю.Еремина, Ю.В.Лопатина, Е.И.Баканова, А.И.Фролова, И.В.Ибрагимхалилова, М.А.Алексеев, Е.Н.Басова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 апреля 2008 г. N 1).

3. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 4 мая 2008 г. Введены в действие с 1 августа 2008 г.

4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

1. Область применения

Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений государственного санитарно-эпидемиологического надзора, разрабатывающих стратегию и тактику применения инсектицидов и занимающихся дезинфекционной деятельностью, исследованием инсектицидной активности различных веществ и препаративных форм на их основе, рекомендуемых для целей медицинской дезинсекции, a также могут быть использованы другими организациями.

2. Общие положения

Устойчивость насекомых к инсектицидам подразделяется на природную и приобретенную. Насекомые на разных стадиях развития обладают различной природной чувствительностью к инсектицидам, относящимся к разнообразным группам химических веществ. Так, куколки насекомых значительно устойчивее к действию инсектицидов по сравнению с другими стадиями развития. Чувствительность к инсектицидам зависит от физиологического состояния насекомых и может также различаться у голодных и напитавшихся особей.

Приобретенная устойчивость к инсектицидам напрямую связана с инсектоакарицидным прессом. Формирование резистентных популяций вредных организмов под воздействием пресса пестицидов является одной из центральных проблем их эффективного использования. Резистентность (приобретенная устойчивость) рассматривается как адаптация популяции определенного вида насекомых к воздействию пестицидов, и поэтому она входит в круг вопросов, относящихся к химической экологии.

Резистентность является общебиологическим понятием. В настоящее время приобретенная устойчивость к инсектоакарицидам, фунгицидам и гербицидам выявлена как у вредных, так и у полезных организмов. Среди вредных членистоногих резистентные популяции обнаружены у вредителей сельскохозяйственных культур и животных, а также у членистоногих, имеющих эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение.

Количество видов членистоногих, у которых сформировались резистентные к инсектоакарицидам популяции, неуклонно возрастает. Если в 1945 г. были обнаружены резистентные популяции членистоногих, относящихся к 12 видам, то в 1967 г. - к 224, в 1975 г. - к 364 видам. По данным Дж. Кригер [19], более 500 видов насекомых к середине 80-х годов XX в. имели популяции, резистентные к инсектицидам.

Наиболее полный перечень видов членистоногих, имеющих эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение, у которых выявлены резистентные популяции, приведен в 15-м Докладе Комитета Экспертов ВОЗ [11]. Согласно этим данным у 147 видов членистоногих, имеющих эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение, сформировались популяции, резистентные к различным по химической структуре инсектоакарицидам. В 2000 г. сообщалось о 198 видах таких членистоногих [17]. В 2006 г. эти материалы были дополнены [12].

Определение уровня чувствительности членистоногих к используемым и рекомендуемым действующим веществам (ДВ) инсектицидов является необходимым элементом при планировании и осуществлении программ истребительных мероприятий. Резистентность - динамичное явление, развивающееся в различных пределах у разных видов и даже у одного и того же вида при различном прессе применяемых инсектицидов [2].

Разработанные методические указания посвящены определению уровней чувствительности основных видов насекомых, имеющих эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение.

Для обнаружения и последующего мониторинга резистентности у популяций насекомых, собранных на объектах, необходимо пользоваться относительно простыми методами, позволяющими ограниченному по численности персоналу проводить исследования в короткие сроки. Оперативным методом, рекомендованным Комитетом экспертов ВОЗ по инсектицидам [14], является использование диагностических (дискриминирующих) концентраций или доз.

В основу данных методических указаний положены стандартные методы, рекомендуемые ВОЗ, в ряде случаев - модифицированные в НИИ дезинфектологии (НИИД) или в Институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Марциновского (ИМПиТМ). Главным образом эти изменения касаются времени контакта насекомых с тест-поверхностями, обработанными диагностическими дозами. Согласно методам ВОЗ контакт насекомых с обработанными тест-поверхностями продолжается от нескольких часов (5-10) до нескольких суток (1-5). Однако некоторые насекомые в естественных условиях не контактируют столь длительное время с поверхностями, обработанными инсектицидами, поэтому для установления уровня чувствительности природных популяций ряда видов насекомых целесообразно определить не время контакта членистоногого с поверхностью, обработанной диагностической дозой или концентрацией, а концентрацию (дозу) инсектицида, которая за относительно короткий отрезок времени обеспечивает их максимальную смертность.

В настоящих методических указаниях изложены методы определения уровня чувствительности к инсектицидам рыжих тараканов (Blattella germanica), платяных вшей (Pediculus humanus humanus), постельных клопов (Cimex lectularius), блох на примере крысиной блохи (Xenopsylla cheopis), комнатных мух (Musca domestica), комаров (личинок и имаго) родов Culex, Aedes и Anopheles.

Изучение уровня чувствительности насекомых, собранных на объектах, позволит оптимизировать комплекс дезинсекционных мероприятий.

2.1. Приготовление растворов инсектицидов

Для топикальной обработки насекомых используют не менее 5 концентраций ацетоновых или спиртовых растворов ДВ инсектицидов, полученных путем последовательного разбавления (с шагом разбавления 2 или другим в зависимости от необходимости).

Тест-поверхности обрабатывают, исходя из норм расхода 100 мл/м (1 мл/дм) впитывающей поверхности (фанера, ткань, фильтровальная бумага и др.) и 50 мл/м (0,5 мл/дм) невпитывающей поверхности (стекло). Для обработки контрольных тест-поверхностей используют те же растворители, что и в опытных вариантах.

2.2. Расчет среднесмертельных концентраций и доз

Показатели или ( или и другие величины) для каждого инсектицида определяют методом пробит-анализа путем построения линии регрессии "доза-смертность" ("концентрация-смертность") [10].

Для пересчета величины (), % в величину (), мкг/г определяют среднюю массу одного насекомого в мг. Для этого до опыта взвешивают не менее 50 предварительно анестезированных особей. Вычисление проводят по формуле:

,

где - концентрация, СК, %;

- объем нанесенного раствора, мкл;

- масса насекомого, мг.

2.3. Использование диагностической концентрации

По данным экспериментов, проведенных в лабораторных условиях, рассчитывают диагностические концентрации (ДК) или дозы (ДД). Дозу или концентрацию, равную двум дозам или концентрациям, вызывающим смертность 95% (99%) членистоногих, считают диагностической [18].

Обработка насекомых растворами инсектицидов в диагностической концентрации должна проводиться в 3-5 повторностях. Случайное появление оставшихся в живых особей (например, в 3-х последовательных опытах) служит сигналом, указывающим на необходимость дальнейших исследований. Таким образом, можно обнаружить наличие приобретенной резистентности и установить приблизительно, какую часть в популяции членистоногих составляют резистентные особи. Если в эксперименте погибли все особи, то популяция является чувствительной. Если погибли 80% особей, то в популяции содержится 20% устойчивых особей и т.д. Если в эксперименте погибли 50% особей, то популяция является устойчивой и необходимо установить показатель резистентности ().

Данные, полученные при использовании диагностической концентрации, можно использовать для практических целей при принятии решения о возможности использования данного инсектицида для обработки объекта. Так, если при обработке насекомых растворами инсектицидов в диагностической концентрации погибли менее 40% насекомых, такое средство не следует использовать на данном объекте.

2.4. Критерии оценки уровня чувствительности насекомых, собранных на объектах

Оценку уровня чувствительности насекомых, собранных на объектах или с человека, проводят путем вычисления показателей резистентности () - соотношения показателей (, , ; , , ), полученных для инсектарной культуры и популяции, собранной на объекте, например:  

В зависимости от величины популяция оценивается как "чувствительная", "толерантная" или "устойчивая".

Поскольку уровень чувствительности к инсектицидам у членистоногих в популяциях, собранных на объектах, может значительно различаться, их относят к одной из приведенных ниже групп по степени установленной у них устойчивости. Чувствительность насекомых инсектарной культуры принимают за единицу [18].

I группа. менее 1 - насекомые высокочувствительны к инсектициду.

II группа. равен 1 - насекомые чувствительны к инсектициду.

III группа. в пределах 2-10 - насекомые толерантны к инсектициду.

IV группа. 10 и более - насекомые резистентны к инсектициду.

2.5. Статистическая обработка полученных результатов

Смертность насекомых в опыте в каждой повторности и в контроле вычисляют в процентах по отношению к общему количеству насекомых в повторности. В случае смертности в контроле 5-20% особей в результаты опытов вводят поправку по формуле Аббота [4]. Если смертность членистоногих в контроле превышает 20%, результаты опыта считают недействительными.

Доверительные пределы к показателям () и стандартные отклонения рассчитывают по П.В.Попову [10], П.Ф.Рокитскому [13], Г.Ф.Лакину [4] и др.

2.6. Наборы для опытов

Для проведения опытов необходима биологическая лаборатория, оснащенная термостатами, холодильниками, аналитическими весами, вытяжными шкафами и пр.

Набор для проведения опытов состоит из следующих предметов:

1) стаканы стеклянные или полимерные; 2) бутылки полимерные объемом 2 л; 3) стеклянные пластины размером (10х20) см; 4) чашки Петри 10 см; 5) чашки Петри 4 см; 6) часовые стекла или стеклянные чашки; 7) экспозиметры (9 см) согласно МУ 3.5.2.1759-03 [9]; 8) пипетки; 9) цилиндры; 10) сосуды для отстаивания воды; 11) пробирки стеклянные химические; 12) штативы для пробирок; 13) микродозаторы (петли) или микропипетки; 14) эксгаустеры; 15) стеклянные воронки; 16) энтомологический сачок 4 см; 17) вазелин технический; 18) мелкоячеистая марля для завязывания стаканов; 19) крышки пластиковые с маленькими отверстиями; 20) хлопчатобумажная ткань; 21) резиновые кольца; 22) глазной пинцет; 23) мягкий пинцет; 24) флаконы пенициллиновые с резиновыми крышками; 25) химические пробирки с пробками; 26) лейкопластырь; 27) маркер; 28) ацетон; 29) этиловый спирт; 30) эфир медицинский; 31) резиновые перчатки; 32) фильтровальная бумага (фильтры обеззоленные); 33) ножницы; 34) вата; 35) пробит-логарифмическая бумага для построения линий регрессии; 36) грифельный карандаш; 37) прозрачная линейка; 38) журнал учета данных опытов.

3. Методы определения уровня чувствительности к инсектицидам рыжих тараканов Blattella germanica*

_______________
     * В бумажном оригинале слова "Blatella germanica" выделены курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.

В лабораторных условиях определение уровня чувствительности и диагностической концентрации (дозы) ДВ инсектицида проводят на имаго рыжих тараканов лабораторной чувствительной культуры методом топикального нанесения инсектицида и методом контактирования с обработанными тест-поверхностями.

3.1. Установление исходного уровня чувствительности и диагностических концентраций методом топикального нанесения растворов инсектицидов

Опыты проводят на однородном биоматериале - самцах рыжих тараканов в возрасте от 5 до 15 дней после имагинальной линьки. Для определения качества биоматериала насекомых за 24 ч до начала опыта отбирают из емкости для выращивания и отсаживают в плоский кристаллизатор с кормом и водой.

Ацетоновые или спиртовые растворы ДВ инсектицида наносят из микропипетки или с помощью микродозатора на мезостернум (средне-грудь) анестезированных тараканов по 1 мкл на каждое насекомое. В контрольном варианте на тараканов наносят 1 мкл растворителя, использованного при приготовлении растворов инсектицида. После нанесения инсектицида насекомых помещают в чистые стаканы (стеклянные или полимерные) со смазанными вазелином краями.

Опыты проводят не менее чем в трех повторностях для каждой концентрации. В каждой повторности используют не менее 10 насекомых, в контрольном варианте - не менее 20 особей. Опыты проводят при температуре воздуха (23±2) °С и относительной влажности 50-70%. Учет гибели насекомых проводят через 24 и 48 ч. В категорию "пораженных" включают мертвых и парализованных насекомых. Парализованными считают тараканов, не способных к самостоятельному передвижению.

Исходный уровень чувствительности самцов рыжих тараканов лабораторной чувствительной культуры приведен в табл.1.

Таблица 1

     
Исходный уровень чувствительности самцов рыжих тараканов лабораторной чувствительной культуры и диагностические концентрации при топикальном нанесении ДВ инсектицидов (учет через 24 ч)