ГОСТ Р ИСО 10993-10-2009 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 10. Исследования раздражающего и сенсибилизирующего действия

Приложение C
(справочное)

Дополнительная информация

C.1 Дополнительная информация по раздражающему действию

Исследование кожного раздражения мелких животных проводится для идентификации материалов, которые могут являться потенциальными раздражителями кожи и/или слизистой оболочки человека. Первичным раздражителем является материал, вызывающий воспалительные изменения кожи в результате прямого поражающего воздействия, охарактеризованного наличием воспаления, или, при сильном раздражителе, везикуляцией и/или некрозом.

Кролик является наиболее предпочтительным испытуемым животным, что подтверждается наличием обширной информации по кожному раздражению в этих животных в Регистре токсического действия химических веществ (RTECS). Из более чем 2000 записей в RTECS 85% сообщают о результатах исследований на кроликах, 7,5% - на человеке, 4% - на мышах и 3% - на морских свинках. В результате, кроликов используют для получения значительного большинства существующих данных в открытом доступе. Очистка от шерсти участка исследования не является необходимой, так как данные указывают на похожие ответы на выскобленных и невыскобленных участках.

Исследования кожного раздражения могут давать различные результаты вследствие вариации ряда различных факторов, связанных с исследованием, таких как реципиент, тестовая доза, размеры аппликации, степень окклюзии, длительность воздействия, наполнитель, время считывания и качество считывания данных. Таким образом, в исследования кожного раздражения на человеке важно включить хорошо известные материалы положительного и отрицательного контролей для сравнения результатов исследования с контрольными материалами, что позволяет соотнести результаты. В качестве раздражителя положительного контроля преимущественно выбирают додецилсульфат натрия (SDS) чистотой, более или равной 99%, так как это наиболее широко используемый контрольный раздражитель в клинических испытаниях [2], [4], [31]. Он также легко и широко доступен и не имеет других негативных эффектов. Нонановая кислота, способ действия которой отличается от SDS, также может использоваться как положительный контроль [18], [19].

Воздействие SDS определяет группу человеческих добровольцев и служит отправной точкой. SDS классифицируется как кожный раздражитель согласно критериям ЕС (88/379/EEC Директива совета от 7 июня 1988 г.). Тем не менее, не ясно, находится ли SDS на пороговом уровне ответа, при котором химикаты должны рассматриваться как кожные раздражители, или близко к таковому. Таким образом, вместо использования материала в чистом виде, более пригодно взять в качестве отправной точки минимальный уровень SDS, признанный, по меньшей мере, одной региональной группой (ЕС) значительным острым кожным раздражителем, каковым является 20%-ный (массовая концентрация) водный раствор [31].

Использование лабораторных животных для исследования кожного раздражения снижается по причине разработки моделей in vitro и более частого использования пациентов-добровольцев [10], [14]. Для исчисления ответа на раздражитель используют биоинженерные или неинвазивные, объективные методы измерения, что снижает зависимость от более субъективной визуальной шкалы замера [12], [16], [17]. Тем не менее, десятилетия опыта были приобретены благодаря исследованию кожного раздражения Драйза (Draize) на кроликах-альбиносах. Данный метод приведен в [8]. Исследуемый материал применяют на неповрежденных участках выстриженной спины под кусочками марли. Аппликации наносят на трех кроликов. Кусочки марли прикрепляют пластырем, а все туловище животного оборачивают полуокклюзионной или окклюзионной повязкой на 4 ч. После 4 ч кусочки марли снимают, исследуемые участки очищают и спустя 1 ч, любую результативную реакцию оценивают на предмет наличия эритемы или отека. Реакцию также оценивают через 24, 48 и 72 ч.

Исследование раздражения глаза на кроликах было разработано для прогнозирования раздражения глаза у человека [27]. Для оценки степени глазного раздражения Draize [26] опубликовал иллюстрированное пособие по системе оценки степени раздражения.

Альтернативные методы in vitro для исследования эффекта глазного раздражения находятся в стадии разработки, но еще не обоснованы и не утверждены на международном уровне [21].

Обширные данные по кожному раздражению у человека представлены Исследовательским институтом душистых веществ (Research Institute for Fragrance Materials). Монографии по эфирным маслам и другим ароматическим соединениям опубликованы в Food and Cosmetic Toxicology ("Пищевая и косметическая токсикология"). Проект Руководства OECD по исследованию острого кожного раздражения на пациентах-добровольцах предоставляет дополнительную справочную информацию. Группа химиков, участвующих в программе разработки Руководств OECD, пока не достигла согласия о необходимости создания Руководства OECD по местным кожным эффектам у пациентов-добровольцев.

С.2 Дополнительная информация по исследованиям сенсибилизации на выявление гиперчувствительности замедленного типа

Сенсибилизация у человека наступает после однократного или многократного накожного воздействия, инициируется и запускается компонентами иммунной системы. Особенно важно, чтобы гаптен (химикат) являлся существенным по отношению к коже и обладал проникающей способностью. Затем он вступает в реакцию с белками кожи для формирования иммуногенных комплексов. Клетки Лангерганса на эпидермальной/дермальной границе вырабатывают антиген на специфические лимфоциты, которые затем активируются для инициации иммунных ответов. Небольшой процент этих лимфоцитов является клетками долгосрочной памяти, которые служат основными активаторами в провокационной фазе. Таким образом, последующие повторные воздействия могут привести к негативным реакциям, которые сопровождаются выбросом лимфокинов активированными лимфоцитами и другими воспалительными клетками, привлеченными в зону раны.

В 1895 Jadassohn, используя метод аппликаций, обнаружил у пациента клинически контактную аллергию на ртуть. Этот новаторский подход предоставил научную базу для последующих исследований, направленных на диагноз и прогноз контактной аллергии у человека и животных. Развитие перспективных/прогнозирующих исследований для оценки сенсибилизирующего потенциала химикатов последовало за новаторской работой Landsteiner и Chase [49], которые твердо обосновали использование морских свинок для изучения гиперчувствительности замедленного типа.

Magnusson и Kligman [50] опробовали множество вариантов исследований на морских свинках и предложили процедуру максимизации на морских свинках (GPMT), основанную на внутрикожных инъекциях (с полным адъювантом Фрейнда [FCA] или без него) и последующих местных аппликациях исследуемого материала на тот же участок. Предложенная методика требует предварительной обработки испытуемого участка, если исследуемый материал не является раздражителем. Как правило она достоверно обнаруживает слабые сенсибилизаторы, так как понятие "слабый" включает нулевую вероятность положительных реакций. Этот чувствительный метод широко используется. Применение полного адъюванта Фрейнда повышает чувствительность метода исследования и, в некоторых случаях, может переоценить сенсибилизирующий потенциал испытуемого соединения.

В 1965 Buehler [41] предложил использование закрытых аппликаций для обеспечения окклюзии как метод для оптимизации воздействия и приближения к условиям процедур, используемых на человеке (Human Repeat Insult Patch Test HRIPT). Высказывалось предположение, что методика окклюзивной аппликации является чувствительной и точно прогнозирует средние и сильные сенсибилизаторы, таким образом, предотвращая вероятность негативных реакций у человеческих моделей при повторной накожной пробе (Human Repeat Insult Patch Test: HRIPT). Представленные данные показали преимущества окклюзии по сравнению с внутрикожными инъекциями и местным применением открытого типа. Стимуляция иммунной системы адъювантами не использовалась. Данный метод признан достаточно чувствительной процедурой для определения самых слабых сенсибилизаторов и доказан как достаточно гибкий для использования в процедуре оценки риска. Тем не менее, исследование закрытой аппликацией (исследование Бюлера) менее чувствительно по сравнению с GPMT [46].

Эти два исследования, метод закрытой аппликации и максимизации, наиболее часто использовались для оценки безопасности в Соединенных Штатах Америки и в Европе. Они также являются предпочтительными методами исследований в действующих Руководствах по исследованиям ОECD и ЕС. Результаты сенсибилизирующих проб на морских свинках зависят от многих факторов, связанных с животными и с техническими аспектами, что объясняет различия в результатах исследований разных лабораторий, например, линия животных, их пол, возраст, окружающие условия исследования, исследуемый участок на животном, метод удаления шерсти (стрижка/бритье) или химическая депиляция, тип конфигурации аппликации, число исследуемого материала, качество окклюзии, время воздействия и считывание тканевого ответа. Были использованы и изучены многочисленные другие исследования, и у каждого из них есть свои сторонники. В настоящий момент существует несколько методик, признанных приемлемыми в нормативных целях, при условии, что методика отражена документально надлежащим образом и обоснована исследователем. Во всех случаях процедуры следует проводить в соответствии с первоисточником. Список других исследований приведен в таблице C.1.

Таблица С.1 - Альтернативные методы исследования сенсибилизации замедленного типа

Недавняя монография ECETOC приводит новейшую информацию по исследованию накожной сенсибилизации [44].

Последняя проба в таблице C.1, местная проба на лимфоузле мыши (LLNA), заслуживает особого внимания. Местная проба на лимфоузле мыши (LLNA) была принята Организацией Экономического Сотрудничества и Развития (ОECD) как самостоятельная альтернатива проводящимся исследованиям на морских свинках и как метод улучшения обращения с животными [83].

Научной базой для исследования является измерение введенного 3H-метил-тимидина в лимфоциты в дренируемых лимфоузлах мыши под местным воздействием испытуемого образца как показатель сенсибилизации. Это исследование не включает провокационную фазу. Конечной интересующей точкой является индекс стимуляции, означающий соотношение введенного тимидина в лимфоузлы животных, получивших дозу воздействия, с введенным в лимфоузлы контрольной группы. Исследование является положительным, когда индекс стимуляции превышает 3 (SI>3). Внутри- и межлабораторная оценки LLNA показали воспроизводимое соотношение доза - ответ внутри и между лабораториями [60], [76], [78], [72], [59], [65], [82]. Тем не менее, сообщалось о трудностях в различии между раздражающими и аллергенными веществами при использовании LLNA [72], [62], [79]. Таким образом, LLNA может производить ложноположительные результаты с раздражителями и может переоценить аллергенность веществ, имеющих и раздражающие, и аллергенные свойства [59]. Тем не менее, у LLNA есть преимущества по сравнению с пробами на морских свинках по причине более короткой продолжительности исследования, более объективной конечной точки, меньшего объема требуемого испытуемого вещества, а также это исследование не включает инъекции полного адъюванта Фрейнда. Возможны усовершенствования методики исследования путем использования анализа маркеров активации клеток и цитометрии потока [68], [69]. Не установлено, могут ли они быть внедрены на практике в стандартные протоколы LLNA для обычной токсикологии. С другой стороны, LLNA ограничивает выбор тестовых растворителей; в большинстве исследований использовалась смесь ацетона и оливкового масла. Недавнее исследование демонстрирует вариабельность результатов с использованием разных растворителей [77]. Кроме того, при использовании LLNA невозможно изучать провокационную фазу или конфигурации перекрестной реактивности, так как животных умерщвляют после индукции до забора лимфоузлов.

Проба подколенного лимфоузла (PLNA), использующая подкожное введение в подушечку стопы [63], [66], [81], является альтернативой пробе на лимфоузле. В данной пробе, кроме прямого измерения активации лимфоузла, возможно использование антигенов-репортеров для дальнейшего прояснения иммуномодуляции, вызванной исследуемым химикатом [58].

Процесс оценки риска не должен полагаться на единственную модель или подход; его проведение должно быть продумано для предоставления максимальной гарантии безопасности потребителю. Как правило, это требует исследований на животных моделях и человеческих экспериментальных моделях. Требуется определенная гибкость при выборе моделей и методов при наличии соответствующей документации и/или обоснования выбора.

Отрицательный ответ, полученный на морских свинках, при надлежащем проведении может быть определяющим, если исследуемая концентрация имеет достаточный фактор безопасности при условиях использования. Тем не менее, необходимо избегать классификации исследуемых материалов исключительно на основании вероятности и/или тяжести, без должного учета использования этого продукта в будущем.

Риск, т.е. вероятность и тяжесть аллергической реакции на продукт, определяется, в основном, следующими четырьмя факторами: сенсибилизирующий потенциал химического аллергена, его число в продукте, биодоступность и условия воздействия. Относительный сенсибилизирующий потенциал химических веществ может быть определен минимальной индукционной концентрацией, необходимой для стимуляции данного уровня сенсибилизации: чем меньше эта концентрация, тем выше потенциал аллергена [80], [40]. Было продемонстрировано, что значительное число случаев аллергического контактного дерматита обнаруживалось у потребителей, когда остаточный уровень аллергена в продукте превышал его минимальную индукционную концентрацию, полученную путем GPMT [51].

С другой стороны, прогнозирующее исследование смесей и продуктов гораздо менее обоснованно и может проводиться после исследования ингредиентов продукта. Соответственно, план исследования и интерпретация результатов могут быть неопределенными, несколько примеров подтверждают и отражают эту возможность. В исследованиях на животных с экстрактами ацетона из свитера, вызвавшего контактный дерматит у людей, были выявлены аллергены (хлорофенилгидразоны фосгена) [48]. В другом случае, в результате исследования на животных с экстрактами ацетона/хлороформа из резиновых сапог, вызвавших контактный дерматит у человека, были выявлены каузативные аллергены меркаптобензотиазол и дибензотиазилдисульфид [47]. Была ясно продемонстрирована необходимость использования надлежащего органического растворителя. Экстракты, подготовленные с органическим растворителем, вызвали гиперчувствительность на морских свинках, в то время как экстракты с солевым раствором не вызвали такой реакции.