МУК 4.2.2413-08 Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы

3. Общие положения

Сибирская язва (Anthrax) - это острое инфекционное заболевание животных и человека, относящееся к группе особо опасных инфекций. Основным источником инфекции для человека при сибирской язве являются больные травоядные животные. Они в течение всего периода болезни выделяют возбудитель с мочой, испражнениями и слюной в почву, которая становится его дополнительным резервуаром. Заражение животных происходит главным образом алиментарным (через корм и питьевую воду, инфицированные спорами), реже - трансмиссивным (через укусы кровососущих насекомых) и воздушным путями.

В подавляющем большинстве случаев человек заражается сибирской язвой при разделке туш вынужденно убитого скота; употреблении в пищу полученных от него мяса или мясных продуктов; непосредственном контакте с трупами погибших животных, шерстью, шкурами, кожей, щетиной, зараженными возбудителем; уходе за больными животными. Возможно также заражение через укусы кровососущих насекомых, контаминированную почву и при вдыхании содержащего споры аэрозоля.

В зависимости от путей заражения у человека развивается кожная или висцеральная (кишечная, легочная) формы сибирской язвы. Любая из этих форм может приводить к развитию сепсиса и осложняться сибиреязвенным менингитом (генерализованная форма).

Возбудитель этой инфекции в 2001 г. в США был использован как средство биологического терроризма, что привело к человеческим жертвам и возникновению паники среди населения. Поэтому своевременная и точная лабораторная диагностика сибирской язвы приобретает сейчас особое значение.

Диагностика сибирской язвы у человека и животных основывается на эпизоотологических, эпидемиологических, клинических, лабораторных и патологоанатомических данных. Лабораторные исследования направлены на обнаружение и идентификацию возбудителя сибирской язвы, выявление специфических антител и аллергической перестройки в организме больных людей.

3.1. Краткие сведения о возбудителе сибирской язвы

Возбудитель сибирской язвы - В. anthracis, относится к семейству спорообразующих микроорганизмов Васillасеае, роду Bacillus. В роду Bacillus, насчитывающем 101 вид, выделяют группу видов Bacillus cereus, в которую входят близкородственные В. cereus, В. anthracis, В. thuringiensis, В. mycoides и недавно признанный новым видом психротолерантный микроб В. weichenstephanensis.

Морфология В. anthracis. В зависимости от стадии развития культуры, а также условий окружающей среды, возбудитель сибирской язвы может существовать в трех формах - в виде бескапсульных вегетативных палочек (бацилл), инкапсулированных палочек и спор.

В мазках из культур, выросших на питательных средах, палочки (размеры 1-1,5x6-8-10 мкм) расположены длинными цепочками, концы микробов в окрашенных препаратах обрублены и цепочка напоминает бамбуковую трость с коленчатыми сочленениями (прилож.7, рис.1). В мазках из патологического материала палочки расположены поодиночке, попарно или короткими цепочками, окружены хорошо выраженной капсулой, зачастую общей для группы микробов (прилож.7, рис.2).

Спорообразование. При выращивании возбудителя на питательных средах и в условиях окружающей среды, при свободном доступе кислорода воздуха, определенной влажности и температуре от 12,0 до 42,5 °С образуются споры овальной формы размером 0,8-1х1,2-1,5 мкм. В каждой вегетативной клетке (спорангии) образуется только одна спора, располагающаяся центрально, ее диаметр не превышает ширину тела микробной палочки (прилож.7, рис.3).

Процесс спорообразования состоит из четырех основных стадий: подготовительной, образования проспор, готовых спор и зрелых спор. Спорогенез зависит от особенностей штамма, наличия тех или иных питательных веществ, рН среды, температуры выращивания, влажности и др.

При попадании спор в благоприятные условия (влажность, аэрация, температура, наличие необходимых питательных веществ) из них быстро образуются вегетативные клетки. Время прорастания спор может составлять несколько часов и зависит от температуры (оптимум - 37 °С) и других факторов.

Культурально-биохимические свойства. Сибиреязвенный микроб - факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 34-37 °С, оптимальное значение рН 7,2-7,8, неподвижный, хорошо растет на обычных питательных средах - МПБ и МПА. Характер роста в совокупности с другими признаками учитывается при идентификации.

При посевах на чашки Петри с питательным агаром после суточной инкубации при (36±1) °С микроб формирует крупные шероховатые сухие матовые колонии в R-форме, с "шагреневой" поверхностью, с неровными краями и отходящими от них волнистыми отростками. При малом увеличении под микроскопом (7x10) они напоминают локоны волос или львиную гриву (прилож.7, рис.4).

Характерный придонный рост сибиреязвенного микроба в МПБ или 1%-й пептонной воде похож на комочек ваты, с трудом разбивающийся при встряхивании, при этом бульон остается прозрачным (прилож.7, рис.5).

Сибиреязвенный микроб способен разлагать с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, сахарозу и некоторые другие сахара, но не разлагает лактозу. Обладает относительно низкой протеолитической активностью и при посеве уколом в столбик 10-12%-го мясопептонного желатина и выращивании при 22 °С рост микроба напоминает елочку, опрокинутую верхушкой вниз; на 3-5 день желатин разжижается в виде воронки. Большинство сапрофитов полностью разжижает желатин в более короткие сроки. При росте на кровяном агаре с 3-5% дефибринированной крови барана через 20-24 ч гемолиз не наблюдается, в то время как многие сапрофиты дают быстрый гемолиз (через 12-18 ч при 37 °С). Большинство штаммов сибиреязвенного микроба не образует фермент лецитиназу. При росте на агаре с куриным желтком вокруг колоний не происходит помутнения среды в виде беловатой зоны, а при посеве на жидкую желточную среду желток не свертывается даже при 5-6-суточном инкубировании. Сапрофиты свертывают желток в течение 6-10 ч. Сибиреязвенный микроб, в отличие от сапрофитных бацилл, обладает низкой фосфатазной активностью и не способен разлагать фосфаты, добавляемые в питательную среду (тест на фосфатазу).

Большинство штаммов сибиреязвенного микроба чувствительны к пенициллину и при выращивании на МПА или МПБ в присутствии 0,5-0,05 ЕД/мл бензилпенициллина через 3 ч инкубирования образуют цепочки из шарообразных клеток - "жемчужное ожерелье" (прилож.7, рис.6).

До 95% штаммов сибиреязвенного микроба лизируется сибиреязвенными бактериофагами "Гамма", "К" и Fah-ВНИИВВиМ (прилож.7, рис.7).

Чувствительность к антибиотикам. Возбудитель сибирской язвы чувствителен к большинству антибиотиков - цефалоспоринам I поколения, тетрациклинам, рифампицинам, аминогликозидам и фторхинолонам. Пенициллин способен задерживать развитие сибиреязвенного микроба даже при низкой концентрации в питательной среде. К некоторым макролидам сибиреязвенный микроб умеренно устойчив, а к цефалоспоринам II-IV поколения устойчив.

Факторы вирулентности (агрессии). Возбудитель сибирской язвы обладает почти универсальной патогенностью для млекопитающих - человека и других приматов, сельскохозяйственных и диких животных, лабораторных животных.

Важнейшими факторами патогенности у микроба являются капсула и экзотоксины. Сибиреязвенный микроб образует их в инфицированном макроорганизме или при культивировании на искусственных питательных средах в специальных условиях.

Наличие капсулы необходимо на первых этапах инфекционного процесса для предотвращения опсонизации и фагоцитирования микроорганизма.

Типичные вирулентные штаммы В. anthracis образуют капсулу в организме больных людей и животных, а также при культивировании на 1%-м бикарбонатно-сывороточном агаре в атмосфере, содержащей 5-50% углекислоты или на жидкой среде ГКИ, содержащей 40% инактивированной бычьей (лошадиной) сыворотки и 60% раствора Хенкса. На 1%-м бикарбонатном агаре микроб растет в SM-форме в виде гладких, блестящих, влажных, слизистых колоний с неровными краями (прилож.7, рис.8).

Экзотоксин играет ведущую роль в патогенезе сибиреязвенной инфекции и формировании специфического иммунитета. Сибиреязвенный экзотоксин относится к бинарным двухкомпонентным белковым токсинам АВ-типа и обладает двумя разными биологическими активностями. Компонентами токсина являются ОФ, ПА и ЛФ. Это белки с молекулярными массами 89,83 и 85 кДа. В настоящее время можно встретить сообщения о двух токсинах - отечном (ОФ+ПА) и летальном (ЛФ+ПА), в которых эффекторную функцию выполняют ОФ и ЛФ (А-субъединицы), а акцепторную и интернализирующую функции - ПА (В-субъединица).

Геном типичных штаммов сибиреязвенного микроба представлен одной кольцевой хромосомой и двумя плазмидами. Токсинообразование и капсулообразование детерминированы плазмидами рХО1 и рХО2. Отсутствие хотя бы одной из этих плазмид приводит к снижению вирулентности вплоть до полной ее утраты.

В природе, наряду с "классическими" диплазмидными штаммами, с меньшей частотой встречаются атипичные моно- и бесплазмидные варианты возбудителя.

3.2. Исследование на сибирскую язву