ГОСТ Р 53244-2008 (ИСО 21570:2005) Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот

Приложение А
(рекомендуемое)

Метод, специфический для целевого таксона

А.1 Метод определения абсолютного количественного содержания ДНК гена adh1 из кукурузы (специфический для целевого таксона) с использованием метода ПЦР в реальном времени

А.1.1 Введение

В этом приложении описан метод специфической амплификации и количественного определения (вспомогательного) гена adh1 (кодирующего алкогольдегидрогеназу 1) из кукурузы (Zea mays) для определения содержания ДНК кукурузы или для обнаружения присутствия/отсутствия в растворах ДНК, экстрагированной из продуктов, содержащих кукурузную ДНК, например, из пищевых продуктов, детектируемых количеств ингибиторов ПЦР.

Ограничения см. в А.1.8.

А.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров

А.1.2.1 Общие положения

Метод был оптимизирован для ДНК, экстрагированной из чистых размолотых кукурузных зерен, листьев кукурузы и сертифицированных стандартных материалов (серий IRMM-411, IRMM-412, IRMM-413 [13], [14]).

Воспроизводимость описанного метода была проверена с помощью совместных испытаний лабораторий с использованием неизвестных образцов (от U1 до U6), состоящих из ДНК кукурузы дикого типа с различным числом копий соответствующей целевой последовательности (см. А.1.2.2), а также в других совместных испытаниях лабораторий в комбинации с методами, специфическими для трансформационных событий ГМ-кукурузы.

Число копий целевой последовательности на гаплоидный геном должно быть равно единице [14].

Должна быть установлена аллельная стабильность целевой последовательности [14].

А.1.2.2 Совместные испытания лабораторий*

________________

* Подтверждение достоверности (валидация) метода было проведено в ходе совместных испытаний лабораторий, организованных Объединенным исследовательским центром Еврокомиссии (EC-JRC) и Институтом защиты здоровья и потребителей (IHCP) в соответствии с Международным протоколом гармонизации [15].

Для построения калибровочной кривой для определения абсолютного количества гаплоидных геномов кукурузы в неизвестных образцах были использованы шесть образцов (S1-S6) ДНК кукурузы дикого типа (экстрагированной из материала листьев [16], содержащей известное абсолютное число копий (183486, 61162, 20387, 6796, 2265 и 755) гаплоидных геномов кукурузы. Абсолютное число копий в известных образцах было определено путем деления массы ДНК (определенной методом флуориметрического количественного определения двухцепочечной ДНК производства фирмы PicoGreen, Molecular Probes, Cat. Number P-7589) на опубликованное среднее значение 1С для геномов кукурузы (2,725 пг) [17].

Шесть образцов (U1-U6) ДНК кукурузы дикого типа (экстрагированной из материала листьев [16]) были использованы в качестве неизвестных образцов. Ожидаемое число копий в неизвестных образцах было определено тем же методом, что и в известных образцах.

Результаты подтверждения достоверности метода, полученные в ходе совместных испытаний лабораторий, суммированы в таблице А.1.

Таблица А.1 - Данные валидации

Валидация метода была также проведена в комбинации с методами, специфическими для трансформационных событий для нескольких образцов ГМ-кукурузы, например, для сладкой кукурузы Bt11. Подробности комбинированных испытаний (относительного количественного определения) см. в [18] и [19].

А.1.2.3 Молекулярная специфичность

А.1.2.3.1 Общие положения

Метод был разработан для использования в качестве целевой части последовательности, описанной в EMBL/GenBank/DDBJ, регистрационный номер X04050. Эта последовательность является уникальной для Zea mays (кукуруза/маис) и Zea mays subsp. diploperennis (теосинте мексиканского) [14].

А.1.2.3.2 Теоретическая специфичность

Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска в базах данных EMBL/GenBank/DDBJ с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN на сайте Национального института здравоохранения США [9 октября 2003 г.]. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемыми целевыми последовательностями.

А.1.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности

Специфичность метода была проверена в отношении широкого диапазона нецелевых таксонов и 20 различных линий кукурузы, представляющих географическое и филогенетическое разнообразие образцов [14]. Не было обнаружено перекрестной реактивности с нецелевыми таксонами (за исключением теосинте мексиканского Zea mays subsp. diploperennis, дикого предка культурной кукурузы) [14], [20]. Были установлены число копий и аллельная стабильность целевой последовательности у различных линий кукурузы [14].