ГОСТ Р 53360-2009 Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности фитазы

     5 Метод определения ферментативной активности фитазы с образованием фосфорнованадиево-молибденового комплекса

5.1 Характеристика метода

5.1.1 Метод основан на определении содержания неорганических фосфатов (РО), образующихся в результате действия фермента фитазы на субстрат - фитат натрия (натриевую соль фитиновой кислоты) - при определенных стандартных условиях, путем их связывания ванадиево-молибденовым реактивом с образованием фосфорнованадиево-молибденового комплекса желтого цвета.

5.1.2 За единицу фитазной активности (1 ед. ФА) принимают количество фермента, катализирующего гидролиз фитата натрия с образованием одного мкмоля неорганического фосфата за одну минуту в стандартных условиях (температура 37 °С, значение рН 5,5, продолжительность гидролиза 15 мин).

5.1.3 Интенсивность окраски измеряют фотоколориметрическим методом при длине волны от 400 до 415 нм.

5.1.4 Количество выделенных неорганических фосфатов определяют по градуировочному графику, построенному как функция оптической плотности от молярной концентрации фосфатов, мкмоль/см.

Метод позволяет определять 0,5-2,0 мкмоль/см фосфатов. Диапазон измерений контролируемого показателя 500-8000 ед. ФА.

5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы

5.2.1 Для определения ферментативной активности фитазы с образованием фосфорнованадиево-молибденового комплекса применяют средства измерений, вспомогательное оборудование, которые указаны в 4.2.1 и 4.2.2.

5.2.2 Для определения ферментативной активности фитазы используют реактивы по 4.2.3, а также:

- аммоний молибденовокислый по ГОСТ 3765;

- аммиак водный особой чистоты по ГОСТ 24147, раствор массовой доли 25%;

- кислоту азотную по ГОСТ 4461, раствор массовой доли 25%;

- аммония метаванадат по ГОСТ 9336;

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

5.3 Подготовка к анализу

5.3.1 Приготовление ацетатного буферного раствора молярной концентрации 0,1 моль/дм с рН 5,5 проводят по 4.3.1.

5.3.2 Приготовление ванадиево-молибденового реактива

В колбу вместимостью 2 дм помещают 0,6 г аммония метаванадата и растворяют в 440,0 см горячей дистиллированной воды. Раствор охлаждают до комнатной температуры и при постоянном перемешивании добавляют 560,0 см 25% раствора азотной кислоты и 25,0 г аммония молибденовокислого. Перемешивают до полного растворения.

Срок хранения при комнатной температуре - один год.

5.3.3 Приготовление раствора субстрата фитата натрия молярной концентрации 5 мкмоль/см проводят по 4.3.4.

Раствор готовят в день проведения анализа.

5.3.4 Приготовление рабочих стандартных растворов фосфатов (РО) для построения градуировочного графика

5.3.4.1 Приготовление основного стандартного раствора фосфатов проводят по 4.3.5.1.

Молярная концентрация фосфатов в стандартном растворе составляет 5 мкмоль/см.