Инструкция по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности

2.6. Определение бродильного титра и коли-титра

2.6.1. Для характеристики санитарно-гигиенических условий производства и реализации продукции устанавливают степень обсеменения продуктов бактериями группы кишечной палочки, т.е. определяют бродильный или коли-титр. Бродильный титр означает наименьшее количество продукта, выраженное в граммах или миллилитрах, в котором обнаружены бактерии группы кишечной палочки, т.е. грамотрицательная палочка, разлагающая глюкозу на кислоту и газ при 43 °С в течение 24 ч (первая бродильная проба). Коли-титр означает наименьшее количество продукта, выраженное в граммах или миллилитрах, в котором обнаружены цитроотрицательные разновидности бактерий группы кишечной палочки (после идентификации).

2.6.2. Посев в среду Кесслер (первая бродильная проба) производят из разведений продуктов в объемах, указанных в табл.8. По 1 мл из выбранных разведений продукта засевают в пробирки со средой Кесслер. Пробирки с посевами помещают в термостат при температуре 43 °С на 18-24 ч. Затем пробирки с посевами просматривают и устанавливают бродильный титр (см. п.2.6.7).

Таблица 8

Примечание. При внутризаводском микробиологическом контроле сырья, полуфабрикатов, готовой продукции допускается ограничивать исследование на наличие бактерий группы кишечной палочки определением только бродильного титра (по первой бродильной пробе).

При отсутствии газообразования через 18-24 ч продукт считают не загрязненным бактериями группы кишечной палочки.

2.6.3. При контроле продуктов, нормированных по содержанию кишечной палочки, из пробирок со средой Кесслер, в которых обнаружено газообразование, допускается проводить идентификацию кишечной палочки, если продукт имеет бродильный титр ниже 0,3 (см. примечание 2 приложения 1) и ниже 0,1 для сухого молока.

Из числа забродивших пробирок производят посев на среду Эндо с таким расчетом, чтобы получить отдельные колонии, для чего берут петлей минимальное количество посевного материала и производят посев частым штрихом. Перед посевом дно чашки со средой Эндо делят на четыре сектора. Посев из каждой пробирки со средой Кесслер производят на отдельный сектор. Чашки с посевами помещают (крышками вниз) в термостат с температурой 37 °С на 18-24 ч.

Примечание. Если газообразование обнаружено в пробирках с большим разведением и отсутствует в пробирках с предыдущим разведением, то на среду Эндо высевают из всех пробирок с предыдущим разведением.

При отсутствии на среде Эндо колоний, типичных для бактерий группы кишечной палочки (красных, нередко с металлическим блеском, розовых, бледно-розовых), продукт считают не загрязненным кишечной палочкой. При наличии на среде Эндо колоний, типичных для бактерий группы кишечной палочки, а также бесцветных, проводят их изучение.

При систематическом обнаружении бесцветных колоний на чашках с агаром Эндо в условиях работы лабораторий, расположенных на территории молочных предприятий, во избежание пропуска патогенных бактерий кишечной группы, указанные чашки должны передаваться в лаборатории санитарно-эпидемиологических станций для дальнейшего изучения.

2.6.4. Из изолированных колоний, характерных для бактерий группы кишечной палочки, делают препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Для приготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметное стекло наносят петлей каплю дистиллированной воды, в которую вносят петлей небольшое количество агаровой культуры, не размешивая в воде. При приготовлении препарата из жидкой культуры на стекло наносят каплю ее. Затем вносят также петлей каплю реактива 1 (см. п.1.2.16). Смесь распределяют на участке примерно в 1 см, подсушивают при комнатной температуре и фиксируют, проводя предметное стекло один раз через пламя горелки. На одном стекле можно готовить по 6-8 мазков, отделяя их один от другого линиями, проведенными с лицевой стороны стекла. Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.

После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2 так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания - 0,5-1 мин. После окрашивания препарат быстро ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат высушивают фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Микробы, красящиеся по Граму (грамположительные), имеют темно-фиолетовый цвет, микробы, не красящиеся по Граму (грамотрицательные), имеют красный цвет.

Бактерии группы кишечной палочки - короткие грамотрицательные палочки.

2.6.5. Из одной проверенной колонии грамотрицательных палочек с каждого сектора Эндо производят высев петлей на среду Козера. Пробирки с посевами помещают в термостат при температуре 37 °С на 18-24 ч.

2.6.6. Отсутствие роста на цитратной среде Козера указывает на присутствие цитроотрицательных разновидностей бактерий группы кишечной палочки.

Изменение оливково-зеленого цвета среды Козера на васильковый свидетельствует о том, что обнаруженные бактерии кишечной палочки относятся к цитратположительным разновидностям, которые не учитывают.

В результате идентификации учитывают все разновидности кишечной палочки, не окрашивающиеся по Граму и вызывающие брожение с образованием кислоты и газа на среде Кесслер при 43 °С, не учитывают разновидности, дающие рост на цитратной среде Козера.

2.6.7. Вычисление коли-титра*.

______________

* Бродильный титр рассчитывается таким же образом по результатам первой бродильной пробы.

2.6.7.1. Молоко и сливки пастеризованные, кефир, ацидофильное молоко, простокваша, ацидофильно-дрожжевое молоко, кисломолочный напиток "Южный" и другие кисломолочные продукты, сливки сгущенные с сахаром (см. табл.9):

а) если ни в одном из засеянных объемов продукта кишечной палочки не обнаружено, то считают коли-титр более 3,0 мл;

б) если в одном из трех засеянных объемов по 1 мл продукта обнаружена кишечная палочка, считают коли-титр 3,0 мл;

в) если кишечная палочка обнаружена в посевах пяти или всех объемов продукта, то считают коли-титр менее 0,3 мл;