Инструкция по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности

1.2. Питательные среды и реактивы

1.2.1. Физиологический раствор. К 1 л водопроводной воды добавляют 8,5 г хлористого натрия, разливают раствор по 10 мл в чистые пробирки диаметром 18-20 мм, а в колбы по 93 мл и стерилизуют при 121 °С в течение 20 мин. После стерилизации в пробирках остается обычно по 9 мл физиологического раствора, а в колбах - по 90 мл, т.е. такое количество, которое необходимо для приготовления разведений из посевного материала.

1.2.2. Мясо-пептонный бульон. Говяжье мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, взвешивают, складывают в кастрюлю, смешивают с двойным количеством водопроводной воды и ставят на 12-14 ч при температуре 4-6 °С. Для ускорения процессов экстракции питательных веществ содержимое кастрюли прогревают при 50 °С в течение 1 ч и затем кипятят 30 мин. После кипячения бульон в горячем состоянии фильтруют через двойной бумажный или ватно-марлевый фильтр. Фильтрат измеряют и добавляют к нему водопроводную воду до первоначального объема, 1% пептона и 0,5% поваренной соли. После установления реакции (рН 7,2-7,4) (см. 1.2.24) бульон разливают в колбы и стерилизуют при 121 °С в течение 20 мин. Бульон перед использованием фильтруют через складчатый фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.3. Мясо-пептонный агар. К мясо-пептонному бульону прибавляют 1,5% агара, предварительно измельченного, замоченного и хорошо промытого водой, и нагревают в автоклаве до 121 °С (без выдержки). Среду в горячем состоянии фильтруют через вату, разливают в пробирки (по 10-15 мл) или бутылки и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

Мясо-пептонный агар может быть заменен сухим питательным агаром, среду из которого готовят по прописи, прилагаемой к каждой порции сухой среды: 5 г порошка всыпать в 100 мл холодной воды, тщательно размешать. Кипятить на слабом огне 1-2 мин с закрытой крышкой или пробкой при помешивании до полного расплавления агара, не допуская пригорания. Профильтровать, разлить в пробирки или бутылки, стерилизовать 20 мин при 121 °С или 30 мин текучим паром 3 дня подряд*.

______________

* Увлажнение, комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о понижении его качества.

При получении каждой новой партии сухого питательного агара качество приготовленной из него среды должно контролироваться. Результаты, получаемые при посеве продукции на среду, приготовленную из сухого питательного агара, должны быть близкими к результатам, получаемым при посеве того же образца продукции на мясо-пептонный агар. В случае, если посев на среду, приготовленную из сухого питательного агара, дает неудовлетворительные результаты, к этой среде добавляют часть мясо-пептонного бульона для приближения ее состава к МПА.

1.2.4. Молочный агар. Приготавливают 2%-ный водный агар и обезжиренное молоко. Обе среды стерилизуют отдельно при 121 °С в течение 10 мин.

При употреблении к расплавленному агару добавляют 20% обезжиренного молока и после тщательного перемешивания смесь выливают в чашки Петри.

1.2.5. Стерильное молоко. Обезжиренное молоко (кислотность 16-18 °Т) разливают в пробирки ( часть их емкости) и затем стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.6. Сусло. Для подсчета плесеней и дрожжей используют неохмеленное пивное сусло. В нем предварительно определяют содержание сахара специальным ареометром с делениями от 1000 до 2000, считая каждые 5 делений равными 1% сахара. В случае излишнего содержания сахара сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6-8%, разливают в колбы и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин. Сусло должно иметь слабокислую реакцию (рН 4,5), благоприятную для роста плесеней.

1.2.7. Сусловый агар. К суслу прибавляют 2 или 3% агара и плавят его, поднимая температуру до 120 °С (без выдержки), затем фильтруют через вату, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин*.

1.2.8. Картофельно-глюкозный агар. Очищенный и нарезанный ломтиками картофель весом 200 г заливают 1 л дистиллированной воды и кипятят в течение 1 ч. Отвар фильтруют, к фильтрату добавляют воду до первоначального объема, 2% глюкозы и 3% агара. Среду разливают по пробиркам (по 10-12 мл) или в колбы и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин. При употреблении устанавливают рН 3,5 при помощи 10%-ного стерильного раствора безводной лимонной кислоты*.

1.2.9. Среда Сабуро. К 1 л дистиллированной воды добавляют 18 г агара и оставляют на 30 мин для его набухания, затем добавляют 40 г мальтозы или глюкозы и 10 г пептона и плавят среду, поднимая температуру до 120 °С (без выдержки). Давлению дают упасть, расплавленную среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают и стерилизуют при 115 °С в течение 15 мин*.

______________

* Для повышения элективности питательных сред, применяемых для учета дрожжей и плесеней, следует добавлять на 1 л среды 50000 Е пенициллина и 40 мг стрептомицина или 350 мг неомицина. Растворы антибиотиков готовят на стерильной дистиллированной воде и добавляют в расплавленный охлажденный агар непосредственно перед заливкой его в чашки Петри.

1.2.10. Гидролизованное молоко. Обычное или восстановленное обезжиренное молоко кипятят и охлаждают до 45 °С. После установления рН 7,6-7,8 к 1 л молока добавляют 0,5-1,0 г порошка панкреатина или 2-3 г поджелудочной железы, пропущенной несколько раз через мясорубку (порошок панкреатина предварительно разводят в небольшом количестве теплой воды). Затем к молоку добавляют 5 мл хлороформа. Колбу закрывают корковой пробкой и выдерживают при 40 °С в течение 18-24 ч. В течение первых часов молоко несколько раз перемешивают (пробку после встряхивания приоткрывают для удаления паров хлороформа). Через 18-24 ч колбу вынимают из термостата, гидролизованное молоко фильтруют через бумажный фильтр, разводят в 2-3 раза водой, устанавливают рН 7,0-7,2 и стерилизуют 15 мин при 121 °С.

1.2.11. Агар с гидролизованным молоком. К приготовленному гидролизованному молоку добавляют 1,5% агара. Смесь расплавляют при 121 °С 15 мин, фильтруют через вату (в теплом автоклаве), разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 121 °С 10 мин.

1.2.12. Среда Кесслер (модифицированная). К 1 л водопроводной воды добавляют 50 мл бычьей желчи [или желчи других сельскохозяйственных животных, или медицинской желчи (билиарина)] и 10 г пептона; смесь кипятят 20-30 мин в водяной бане при перемешивании, фильтруют через вату и затем прибавляют 2,5 г глюкозы. Доводят объем смеси водопроводной водой до 1 л, устанавливают реакцию среды (рН 7,4-7,6) и добавляют 2 мл 1%-ного водного раствора кристаллического фиолетового. Среду разливают в пробирки (по 5 мл) или колбы (по 50 мл) с поплавками.

Стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин. Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет.

Примечание. Может быть использована сухая среда Кесслер, которую готовят по прописи, прилагаемой к каждой партии среды:

1,6 г порошка всыпать в 100 мл холодной водопроводной воды, тщательно размешать, кипятить, помешивая 20-30 мин в водяной бане, и фильтровать через вату. Разлить в пробирки с поплавками и стерилизовать при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.13. Плотная среда Кесслер. К жидкой среде Кесслер добавляют 0,8% агара, среду плавят, а затем фильтруют. Расплавленную среду разливают по 7-8 мл по пробиркам и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.14. Среда Эндо. К 100 мл расплавленного мясо-пептонного агара (рН 7,6-7,8), соблюдая стерильность, добавляют 1 г лактозы (ч), растворенной в 5 мл стерильной воды и подогретой на водяной бане при 100 °С в течение 5 мин. В отдельную пробирку наливают 0,5 мл отфильтрованного 10%-ного спиртового раствора основного фуксина, к которому добавляют свежеприготовленный 20%-ный раствор (водный) сернистокислого натрия (NaSO·7HO) до получения бледно-розового окрашивания. Полученную таким образом смесь добавляют в расплавленный лактозный агар (избегая вспенивания) и разливают в чашки Петри. Среда Эндо должна быть свежеприготовленной. Рекомендуется пользоваться сухой готовой средой Эндо.

1.2.15. Среда Козера (модифицированная). К 1 л дистиллированной воды добавляют 1,5 г фосфорнокислого натрийаммония; 1,0 г фосфорнокислого однозамещенного калия; 0,2 г сернокислого магния; 2,5-3,0 г лимоннокислого натрия, рН среды 6,8-6,9. Раствор стерилизуют в автоклаве при 121 °С в течение 15 мин, добавляют к нему 10 мл 0,5%-ного спиртового раствора бромтимолового синего и разливают в стерильные пробирки, цвет среды после добавления индикатора - изумрудно-зеленый.

1.2.16. Реактивы для окраски по Граму. Реактив 1. К 100 мл этилового спирта добавляют 0,5 г кристаллического фиолетового.

Реактив 2. К 96 мл 0,5%-ного спиртового раствора йодистого калия добавляют 2 мл 5%-ного спиртового раствора основного фуксина и 2 мл 5%-ного спиртового раствора йода.

Примечание. Растворение йодистого калия в спирте рекомендуется проводить в водяной бане при 45-60 °С при постоянном помешивании.