ИНСТРУКЦИЯ
по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности

СОГЛАСОВАНА Заместитель Главного Государственного санитарного врача СССР А.И.Заиченко 5 января 1976 г.

УТВЕРЖДЕНА Заместитель Министра мясной и молочной промышленности СССР М.Г.Лушин 7 мая 1976 г.

Настоящая инструкция по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности составлена Всесоюзным научно-исследовательским институтом молочной промышленности совместно с Всесоюзным научно-исследовательским институтом маслодельной и сыродельной промышленности.

Основной задачей микробиологического контроля в молочной промышленности является обеспечение выпуска продукции высокого качества, повышение ее вкусовых и питательных достоинств.

Микробиологический контроль на предприятиях молочной промышленности заключается в проверке качества поступающих молока, сливок, материалов, закваски, готовой продукции, а также соблюдении технологических и санитарно-гигиенических режимов производства.

При контроле качества сырья необходимо обращать внимание на его общую бактериальную обсемененность и при производстве сыра - на содержание маслянокислых бактерий, при контроле эффективности пастеризации - на содержание бактерий группы кишечной палочки (отсутствие в 10 мл), при контроле заквасок - на их микробиологическую чистоту и активность.

В целях обеспечения выпуска продукции в строгом соответствии с требованиями нормативно-технической документации (ГОСТ, ОСТ, ТУ и др.) большое внимание должно уделяться контролю качества готовой продукции и в случаях его ухудшения - контролю технологических режимов производства с целью определения мест и интенсивности микробиологического обсеменения технически вредной микрофлорой.

Результаты микробиологического исследования качества готовой продукции в отличие от результатов физико-химического исследования из-за длительности анализов не могут быть использованы для задержки выпуска цельномолочной продукции, но по ним судят о санитарно-гигиеническом благополучии предприятия, о целенаправленности микробиологических процессов в технологии производства молочных продуктов, деятельности полезных микроорганизмов и микробиологических причинах появления пороков продукции.

В целях улучшения санитарно-технического режима на предприятиях микробиологическую оценку качества готовой продукции, мойки и дезинфекции технологического оборудования, а также личной гигиены следует включать в оценку качества труда цехового персонала при выплате премиальных доплат.

При организации микробиологического контроля следует руководствоваться настоящей инструкцией по микробиологическому контролю на предприятиях молочной промышленности, а также нормативно-технической документацией на сырье, молочную продукцию, технологическими инструкциями, санитарными правилами, инструкцией по мойке и дезинфекции технологического оборудования, утвержденными положениями об ОТК (лаборатории), микробиологах городских молочных, молочноконсервных и маслодельно-сыродельных заводов и комбинатов.

Настоящая инструкция касается микробиологического контроля сырого молока, сливок, готовой продукции предприятий молочной промышленности (за исключением стерилизованного молока и мороженого), используемых в производстве вспомогательных материалов, контроля по ходу технологического процесса, а также контроля санитарно-гигиенического состояния производства и воздуха рабочих помещений.

1. ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ

     
1.1. Подготовка посуды и материалов

1.1.1. Вся новая посуда, предназначенная для бактериологических работ, кипятится в подкисленной воде (1-2%-ный раствор соляной кислоты в течение 15 мин).

Посуда с питательными средами после подсчета на них кишечной палочки, дрожжей, плесеней и маслянокислых бактерий обеззараживается перед мойкой путем стерилизации в автоклаве при 121 °С в течение 30 мин или кипячением в течение 1 ч.

1.1.2. Вымытую посуду стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при 160 °С в течение 2 ч или паром в автоклаве при 121 °С в течение 20-30 мин с последующим подсушиванием. Перевод давления, показываемого манометром автоклава, в температуру проводится следующим образом:

Чашки Петри, пипетки и т.п. стерилизуют завернутыми в бумагу или в пеналах. В верхнюю часть пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты.

Каучуковые пробки стерилизуют отдельно в автоклаве завернутыми в бумагу (каждая порознь). Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.

При отсутствии автоклава посуду и пробирки, предназначенные для проведения редуктазной пробы, кипятят в дистиллированной воде (или конденсате) в течение 30 мин или хлорируют с последующим ополаскиванием питьевой водой. Кипячение и хлорирование проводят непосредственно перед испытанием.

1.1.3. Изготовленные ватные или марлевые тампоны стерилизуют каждый в отдельности завернутыми в бумагу. Отдельно стерилизуют пробирки с 3-4 мл физраствора при температуре 121 °С в течение 20 мин.

Тампон может быть закреплен на проволоке или деревянной палочке, пропущенной через ватную пробку. В этом случае его вместе с пробкой вставляют в пробирку с 3-4 мл физиологического раствора (тампон не должен касаться раствора) и все вместе стерилизуют при 121 °С в течение 20 мин.

1.2. Питательные среды и реактивы

1.2.1. Физиологический раствор. К 1 л водопроводной воды добавляют 8,5 г хлористого натрия, разливают раствор по 10 мл в чистые пробирки диаметром 18-20 мм, а в колбы по 93 мл и стерилизуют при 121 °С в течение 20 мин. После стерилизации в пробирках остается обычно по 9 мл физиологического раствора, а в колбах - по 90 мл, т.е. такое количество, которое необходимо для приготовления разведений из посевного материала.

1.2.2. Мясо-пептонный бульон. Говяжье мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, взвешивают, складывают в кастрюлю, смешивают с двойным количеством водопроводной воды и ставят на 12-14 ч при температуре 4-6 °С. Для ускорения процессов экстракции питательных веществ содержимое кастрюли прогревают при 50 °С в течение 1 ч и затем кипятят 30 мин. После кипячения бульон в горячем состоянии фильтруют через двойной бумажный или ватно-марлевый фильтр. Фильтрат измеряют и добавляют к нему водопроводную воду до первоначального объема, 1% пептона и 0,5% поваренной соли. После установления реакции (рН 7,2-7,4) (см. 1.2.24) бульон разливают в колбы и стерилизуют при 121 °С в течение 20 мин. Бульон перед использованием фильтруют через складчатый фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.3. Мясо-пептонный агар. К мясо-пептонному бульону прибавляют 1,5% агара, предварительно измельченного, замоченного и хорошо промытого водой, и нагревают в автоклаве до 121 °С (без выдержки). Среду в горячем состоянии фильтруют через вату, разливают в пробирки (по 10-15 мл) или бутылки и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

Мясо-пептонный агар может быть заменен сухим питательным агаром, среду из которого готовят по прописи, прилагаемой к каждой порции сухой среды: 5 г порошка всыпать в 100 мл холодной воды, тщательно размешать. Кипятить на слабом огне 1-2 мин с закрытой крышкой или пробкой при помешивании до полного расплавления агара, не допуская пригорания. Профильтровать, разлить в пробирки или бутылки, стерилизовать 20 мин при 121 °С или 30 мин текучим паром 3 дня подряд*.

______________

* Увлажнение, комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о понижении его качества.

При получении каждой новой партии сухого питательного агара качество приготовленной из него среды должно контролироваться. Результаты, получаемые при посеве продукции на среду, приготовленную из сухого питательного агара, должны быть близкими к результатам, получаемым при посеве того же образца продукции на мясо-пептонный агар. В случае, если посев на среду, приготовленную из сухого питательного агара, дает неудовлетворительные результаты, к этой среде добавляют часть мясо-пептонного бульона для приближения ее состава к МПА.

1.2.4. Молочный агар. Приготавливают 2%-ный водный агар и обезжиренное молоко. Обе среды стерилизуют отдельно при 121 °С в течение 10 мин.

При употреблении к расплавленному агару добавляют 20% обезжиренного молока и после тщательного перемешивания смесь выливают в чашки Петри.

1.2.5. Стерильное молоко. Обезжиренное молоко (кислотность 16-18 °Т) разливают в пробирки ( часть их емкости) и затем стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.6. Сусло. Для подсчета плесеней и дрожжей используют неохмеленное пивное сусло. В нем предварительно определяют содержание сахара специальным ареометром с делениями от 1000 до 2000, считая каждые 5 делений равными 1% сахара. В случае излишнего содержания сахара сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6-8%, разливают в колбы и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин. Сусло должно иметь слабокислую реакцию (рН 4,5), благоприятную для роста плесеней.

1.2.7. Сусловый агар. К суслу прибавляют 2 или 3% агара и плавят его, поднимая температуру до 120 °С (без выдержки), затем фильтруют через вату, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин*.

1.2.8. Картофельно-глюкозный агар. Очищенный и нарезанный ломтиками картофель весом 200 г заливают 1 л дистиллированной воды и кипятят в течение 1 ч. Отвар фильтруют, к фильтрату добавляют воду до первоначального объема, 2% глюкозы и 3% агара. Среду разливают по пробиркам (по 10-12 мл) или в колбы и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин. При употреблении устанавливают рН 3,5 при помощи 10%-ного стерильного раствора безводной лимонной кислоты*.

1.2.9. Среда Сабуро. К 1 л дистиллированной воды добавляют 18 г агара и оставляют на 30 мин для его набухания, затем добавляют 40 г мальтозы или глюкозы и 10 г пептона и плавят среду, поднимая температуру до 120 °С (без выдержки). Давлению дают упасть, расплавленную среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают и стерилизуют при 115 °С в течение 15 мин*.

______________

* Для повышения элективности питательных сред, применяемых для учета дрожжей и плесеней, следует добавлять на 1 л среды 50000 Е пенициллина и 40 мг стрептомицина или 350 мг неомицина. Растворы антибиотиков готовят на стерильной дистиллированной воде и добавляют в расплавленный охлажденный агар непосредственно перед заливкой его в чашки Петри.

1.2.10. Гидролизованное молоко. Обычное или восстановленное обезжиренное молоко кипятят и охлаждают до 45 °С. После установления рН 7,6-7,8 к 1 л молока добавляют 0,5-1,0 г порошка панкреатина или 2-3 г поджелудочной железы, пропущенной несколько раз через мясорубку (порошок панкреатина предварительно разводят в небольшом количестве теплой воды). Затем к молоку добавляют 5 мл хлороформа. Колбу закрывают корковой пробкой и выдерживают при 40 °С в течение 18-24 ч. В течение первых часов молоко несколько раз перемешивают (пробку после встряхивания приоткрывают для удаления паров хлороформа). Через 18-24 ч колбу вынимают из термостата, гидролизованное молоко фильтруют через бумажный фильтр, разводят в 2-3 раза водой, устанавливают рН 7,0-7,2 и стерилизуют 15 мин при 121 °С.

1.2.11. Агар с гидролизованным молоком. К приготовленному гидролизованному молоку добавляют 1,5% агара. Смесь расплавляют при 121 °С 15 мин, фильтруют через вату (в теплом автоклаве), разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 121 °С 10 мин.

1.2.12. Среда Кесслер (модифицированная). К 1 л водопроводной воды добавляют 50 мл бычьей желчи [или желчи других сельскохозяйственных животных, или медицинской желчи (билиарина)] и 10 г пептона; смесь кипятят 20-30 мин в водяной бане при перемешивании, фильтруют через вату и затем прибавляют 2,5 г глюкозы. Доводят объем смеси водопроводной водой до 1 л, устанавливают реакцию среды (рН 7,4-7,6) и добавляют 2 мл 1%-ного водного раствора кристаллического фиолетового. Среду разливают в пробирки (по 5 мл) или колбы (по 50 мл) с поплавками.

Стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин. Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет.

Примечание. Может быть использована сухая среда Кесслер, которую готовят по прописи, прилагаемой к каждой партии среды:

1,6 г порошка всыпать в 100 мл холодной водопроводной воды, тщательно размешать, кипятить, помешивая 20-30 мин в водяной бане, и фильтровать через вату. Разлить в пробирки с поплавками и стерилизовать при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.13. Плотная среда Кесслер. К жидкой среде Кесслер добавляют 0,8% агара, среду плавят, а затем фильтруют. Расплавленную среду разливают по 7-8 мл по пробиркам и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.14. Среда Эндо. К 100 мл расплавленного мясо-пептонного агара (рН 7,6-7,8), соблюдая стерильность, добавляют 1 г лактозы (ч), растворенной в 5 мл стерильной воды и подогретой на водяной бане при 100 °С в течение 5 мин. В отдельную пробирку наливают 0,5 мл отфильтрованного 10%-ного спиртового раствора основного фуксина, к которому добавляют свежеприготовленный 20%-ный раствор (водный) сернистокислого натрия (NaSO·7HO) до получения бледно-розового окрашивания. Полученную таким образом смесь добавляют в расплавленный лактозный агар (избегая вспенивания) и разливают в чашки Петри. Среда Эндо должна быть свежеприготовленной. Рекомендуется пользоваться сухой готовой средой Эндо.

1.2.15. Среда Козера (модифицированная). К 1 л дистиллированной воды добавляют 1,5 г фосфорнокислого натрийаммония; 1,0 г фосфорнокислого однозамещенного калия; 0,2 г сернокислого магния; 2,5-3,0 г лимоннокислого натрия, рН среды 6,8-6,9. Раствор стерилизуют в автоклаве при 121 °С в течение 15 мин, добавляют к нему 10 мл 0,5%-ного спиртового раствора бромтимолового синего и разливают в стерильные пробирки, цвет среды после добавления индикатора - изумрудно-зеленый.

1.2.16. Реактивы для окраски по Граму. Реактив 1. К 100 мл этилового спирта добавляют 0,5 г кристаллического фиолетового.

Реактив 2. К 96 мл 0,5%-ного спиртового раствора йодистого калия добавляют 2 мл 5%-ного спиртового раствора основного фуксина и 2 мл 5%-ного спиртового раствора йода.

Примечание. Растворение йодистого калия в спирте рекомендуется проводить в водяной бане при 45-60 °С при постоянном помешивании.

1.2.17. Среда для определения маслянокислых бактерий. По 5 мл цельного или обезжиренного молока разливают в пробирки (пробирки с 1-1,5 г парафина должны быть стерильными) и затем стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин. Для обогащения среды к молоку до стерилизации можно добавить 0,5-1,0 г глюкозы и 0,5% цистеина.

1.2.18. Среда для обнаружения анаэробов (СДА). Для обнаружения маслянокислых бактерий в молочных продуктах используется также среда следующего состава, %: глюкоза - 0,5; ацетат - 0,5; дрожжевой автолизат - 2; растворимый крахмал - 0,1; цистеин - 0,05; агар-агар - 0,05; гидролизованное молоко - до 100.

Примечание. Цистеин может быть заменен менее дефицитной аскорбиновой кислотой (0,1%).

Среду стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин; рН после стерилизации - 7,1-7,2.

Если СДА используется как плотная питательная среда, то количество агара в ней увеличивается до 1,5%.

Перед употреблением СДА кипятится 20 мин для удаления растворенного в ней кислорода.

1.2.19. Дрожжевой автолизат. 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л воды и помещают в термостат при 55-58 °С на 3 дня. После того помещают в автоклав при 118 °С в течение 15 мин. Затем фильтруют, осадки промывают таким количеством воды, чтобы общее количество фильтрата составляло 4 л.

Фильтрат нейтрализуют 20%-ным раствором едкого натрия до рН 6,8, разливают в пробирки и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.

1.2.20. Среда для обнаружения липолитических бактерий. К 100 мл водопроводной воды добавляют 1 г пептона, 0,3 г дрожжевого автолизата и 1,5 г агар-агара; смесь кипятят 20 мин, фильтруют через вату, доводят объем смеси водопроводной водой до 100 мл и прибавляют 0,1 г двузамещенного фосфорнокислого натрия (NaHPO). Затем устанавливают реакцию среды (рН 7,0-7,4), разливают в колбы (по 100 мл) или в пробирки (по 10-15 мл) и стерилизуют при 121 °С в течение 15 мин. Отдельно готовят говяжий жир, расплавляют его, разливают по 5 мл по пробиркам, затем стерилизуют при 121 °С в течение 15 мин.

1.2.21. Определение активной кислотности (рН) среды. Для определения рН питательной среды применяют электрометрический или колориметрический методы. Электрометрическое определение проводят на потенциометре или рН-метре по прилагаемым к ним инструкциям.

Колориметрическое определение проводят с помощью индикаторных бумажек (ориентировочно), готового универсального индикатора или раствора индикатора, приготовляемого в лабораторных условиях.

Для установления рН применяют 0,04%-ный раствор бромтимолового синего или бромкрезолпурпура. Индикаторы готовят следующим способом: 0,1 г соответствующего индикатора, взвешенного на аналитических весах, растирают в ступке с N раствором NaOH. Для растворения 0,1 г бромтимолового синего берут 3,2 мл N раствора NaOH; для растворения 0,1 г бромкрезолпурпурного берут 3,7 мл N раствора NaOH. К полученному щелочному раствору добавляют 250 мл дистиллированной воды и получают 0,04%-ный раствор. Раствор хранят на холоде в сосудах из темного стекла с притертой пробкой. Бромтимоловый синий изменяет окраску в диапазоне рН 6,0-7,6; он является желтым в кислых средах и синим - в щелочных, давая салатно-зеленую окраску при рН 7,1. Бромкрезолпурпурный изменяет окраску в диапазоне рН 5,2-6,3; он делается бледно-желтым в кислых средах и красно-фиолетовым в нейтральных, давая зеленую с пурпурным оттенком окраску при рН 6,3. Для определения реакции среды на фарфоровую пластинку наносят 1 мл среды и каплю индикатора.