ГОСТ Р 52995-2008
(ИСО 17129:2006)

Группа Н09

     

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО СУХОЕ

Определение содержания соевого и горохового белков с использованием капиллярного электрофореза в присутствии додецил сульфата (SDS-CE). Метод разделения

Milk powder. Determination of soy and pea proteins using capillary electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-CE). Screening method

ОКС 67.100

Дата введения 2010-01-01

     

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") на основе аутентичного перевода международного стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 6 ноября 2008 г. N 288-ст

4 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту 17129:2006 "Молоко сухое. Определение содержания соевого и горохового белка с помощью капиллярного электрофореза в присутствии додецил сульфата (SDS-CE). Метод разделения" (ISO 17129:2006 "Milk powder - Determination of soy and pea proteins using capillary electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-CE) - Screening method"). При этом дополнительные слова, фразы, абзацы, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделены курсивом

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

     1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения соевых и гороховых белковых изолятов в сухом молоке низкотемпературной сушки с помощью капиллярного электрофореза в присутствии додецил сульфата натрия (SDS-CE).

Этот метод не подходит для обнаружения гидролизованных растительных белков в сухом молоке.

     2 Нормативные ссылки*  

________________

* Наименование пункта 2 в бумажном оригинале выделено курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

     3 Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1 соевые и гороховые белки: Массовая фракция соевых и гороховых белков определена по методике, установленной в настоящем стандарте.

     4 Сущность метода

________________

* Наименование пункта 4 в бумажном оригинале выделено курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.      

Молочные белки, присутствующие в испытуемой пробе, выборочно удаляют с применением тетраборатного буфера EDTA для обнаружения малых количеств добавленного растительного белка. В присутствии додецил сульфата натрия добавляют буфер три-HCI и восстанавливают для растворения осадка, чтобы диссоциировать белки и разрушить любые белковые агрегаты, образованные связями S-S. Белки разделяются и определяются капиллярным электрофорезом. Число растительных белков определяют количественно по предшествующей калибровке.

     5 Реактивы

Если не установлено иначе, то применяют реактивы только признанного аналитического качества и воду двойной дистилляции или деминерализованную либо воду эквивалентной чистоты.

5.1 Экстрагирующий буфер

Растворяют 1,14 г десятиводного тетрабората натрия (NaBO·10HO) и 1,49 г дигидрата натриевой соли этилен-диаминтетрауксусной кислоты (EDTA; CHNNaO·2НО) в мерном цилиндре (см. 5.1) в 80 см воды. Разбавляют водой до 100 см и перемешивают.

Проверяют, равен ли рН экстрагирующего буфера раствора 8,3±0,1. Если конечное значение рН выходит за этот интервал, повторяют приготовление экстрагирующего буфера, при этом заменяют все реактивы. Корректировка рН с помощью химических реактивов не допускается.

5.2 Буфер для образца

Растворяют 606 мг три(гидроксиметил)аминометана (CHNO), 1,00 г соли додецилсульфата натрия, (SDS; CHOSNa) и 37 мг EDTA (CHNNaO·2НО) в мерном цилиндре в 80 см воды и перемешивают. Добавляют 14,7 см соляной кислоты, имеющей концентрацию (HCI)=0,1 моль/дм и 2 см 2-меркаптоэталона. Разбавляют водой до 100 см и перемешивают.

Проверяют, равен ли рН буфера для образца 8,7±0,1. Если конечное значение рН выходит за этот интервал, повторяют приготовление экстрагирующего буфера, при этом заменяют все реактивы. Корректировка рН с помощью химических реактивов не допускается.

5.3 Электрофорезный буфер, например Beckman eCAPSDS 14-200 гелевый буфер или эквивалентный.

5.4 Раствор гидроокиси натрия (едкого натра), (NaOH)=0,1 моль/дм.

5.5 Эталонная смесь для испытания, содержащая белки, имеющие молекулярную массу от 10 до 200.

Примечание - В качестве эталонной смеси можно использовать смесь, имеющуюся в продаже.

5.6 Эталонный образец для калибровки с известным процентным содержанием растительного белка, которое поставляется NIZO (Ede, NL). Белковый состав калибрующего образца должен быть также известен.

     6 Аппаратура

6.1 Градуированный мерный цилиндр вместимостью до 100 см.

6.2 Пипетка Пастера.

6.3 Микрососуд с завинчивающейся крышкой вместимостью 1,5 см.

6.4 Лабораторные весы с точностью взвешивания до 0,1 мг.

6.5 Центрифуга, имеющая вращение с радиальным ускорением до 6500 g.

6.6 Измеритель рН, имеющий минимальную чувствительность 0,1 единицы рН, а также стеклянный электрод и соответствующий эталонный электрод с температурной компенсацией.

6.7 Вихревая мешалка (вортекс).

6.8 Термомиксер, Eppendorf 5436 или аналогичный прибор.

6.9 Прибор капиллярного электрофореза с линейным градиентом напряжения.

6.9.1 Колонка, капилляр с гидрофильным покрытием из кварцевого стекла, рабочая длина которого составляет около 20 см (от инжектора до детектора), имеющий внутренний диаметр 75 мкм.

6.9.2 UV детектор, способный проводить измерения приблизительно на 214 нм.

6.9.3 Программа, имеющая способность высчитать контрольное значение из серии опытов на образцах.

6.10 Система данных, выдающая необходимую информацию.

     7 Отбор проб

В лабораторию должна быть доставлена представительная проба. Она не должна быть повреждена или изменена во время транспортирования и хранения.

Отбор пробы рекомендуется проводить по ГОСТ 26809 и [1].

     8 Приготовление к испытанию

8.1 Содержание белка образца для испытания

Общее содержание белка для испытания определяют, используя методы, установленные в [2] и [3].

8.2 Приготовление пробы для испытания

Если содержание белка в пробе для испытания от 30% до 40% от массовой фракции, то взвешивают 126 мг испытуемой пробы с точностью до 0,1 мг в микрососуде с завинчивающейся крышкой. Если содержание белка испытуемого образца выходит за пределы этого интервала, пропорционально меняют массу образца.

В пробе для испытания в микрососуде добавляют 1 см экстрагирующего буфера. Смешивают полученный раствор в вихревой мешалке со скоростью 2500 об/мин в течение 1,5 мин. Дают выстояться в течение 5 мин, а затем перемешивают раствор снова в течение 1,5 мин. Центрифугируют смесь при 6500 g в течение 30 мин. С помощью пипетки Пастера осторожно удаляют надосадочную жидкость с осадка.

Промывают осадок с помощью 1 см экстрагирующего буфера. Центрифугируют промытый осадок при 6500 g в течение 20 мин. С помощью пипетки Пастера осторожно удаляют надосадочную жидкость. Еще раз промывают оставшийся осадок по той же методике.

К промытому осадку в микрососуде добавляют 250 см буфера для образца. Закрывают сосуд и нагревают его при температуре 95 °С в течение 10 мин, перемешивая при этом термомиксером, который установлен приблизительно на 1000 об/мин. Охлаждают сосуд в холодной (ледяной) воде или на льду.

После охлаждения снова центрифугируют сосуд с его содержимым при 3000 g в течение 5 мин. Переносят около 200 см чистой надосадочной жидкости в соответствующий сосуд для впрыскивания, чтобы использовать в качестве испытуемого раствора.

После нагревания образец в микрососуде может также сохраняться в морозилке.

Вышеуказанный этап центрифугирования можно пропустить, если содержимое сосуда прозрачно уже визуально.

     9 Методика испытания*

________________