ГОСТ Р 52996-2008
(ИСО 11816-1:2006)

Группа Н09

     

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ

Определение активности щелочной фосфатазы

Часть 1

Флуориметрический метод для молока и молочных продуктов

Milk and milk products. Determination of alkaline phosphatase activity. Part 1. Fluorimetric method for milk and milk products

     

ОКС 67.100

Дата введения 2010-01-01

     

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") на основе аутентичного перевода международного стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 6 ноября 2008 г. N 289-ст

4 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту 11816-1:2006 "Молоко и молочные продукты. Определение активности щелочной фосфатазы. Часть 1. Флуориметрический метод для молока и молочных продуктов" (ISO 11816-1:2006 "Milk and milk products - Determination of alkaline phosphatase activity - Part 1: Fluorimetric method for milk and milk-based drinks").

При этом дополнительные слова, фразы, абзацы, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделены курсивом

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

     1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает флуориметрический метод для определения активности щелочной фосфатазы (ALP) в пастеризованном цельном, полужирном и обезжиренном молоке. Метод применим для молока коров, овец, коз и для молочных напитков.

Метод также пригоден для определения высокой активности щелочной фосфатазы в сыром и термообработанном молоке с активностью более 2000 мЕ/л после заданного разбавления образца.

     2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

     3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 активность щелочной фосфатазы (ALP активность): Активность щелочной фосфатазы, присутствующей в продукте, определенная методом, установленным настоящим стандартом.

Примечание - Активность щелочной фосфатазы выражена в миллиединицах активности фермента на литр, мЕ/л.

3.2 единица активности щелочной фосфатазы: Объем фермента щелочной фосфатазы, который катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в минуту.

     4 Сущность метода

Активность щелочной фосфатазы для образца измеряется путем непрерывного флуориметрического прямого кинетического анализа. В субстрате нефлуоресцентного ароматического монофосфорного эфира, 2'-[2-бензотиазолил]-6'-гидроксибензотиазол фосфат, в присутствии любой щелочной фосфатазы, образованной из этого образца, происходит гидролиз его фосфатного радикала, производя продукт с интенсивной флуоресценцией. Флуориметрическое измерение активности щелочной фосфатазы проводят при температуре 38 °С в течение трех минут, используя субстрат. Сюда включена преинкубация субстрата и образца с последующим многократным кинетическим считыванием скорости реакции.

Примечание - Хотя испытание длится 3 мин, первая минута является равновесным периодом для обеспечения температуры образца 38 °С. Измерения активности фактически начинаются со второй минуты и продолжаются до конца третьей минуты (т.е. 2 мин).

     5 Реактивы

Используются только реактивы признанной аналитической чистоты, если нет других указаний, и дистиллированная или деминерализованная вода или вода аналогичной чистоты.

5.1 Субстрат Флуорофоса® в пробирках, каждая из которых содержит 144 мг порошка Флуорофоса®.

Этот субстрат нефлуоресцентного ароматического монофосфорного эфира, 2'-[2-бензотиазолил]-6'-гидроксибензотиазол фосфат (Флуорофос®). Субстрат Флуорофоса® остается стабильным в течение двух лет, если его хранить в закрытых пробирках при температуре от 2 °С до 8 °С.

5.2 Буферный раствор субстрата, буферный раствор диэтаноламина (DEA), (DEA)=2,4 моль/дм, с рН 10,0 в пробирках вместимостью 240 см каждая.

Буферный раствор субстрата остается стабильным в течение двух лет, если его хранить в закрытых пробирках при температуре от 2 °С до 8 °С.

5.3 Рабочий субстрат

Оставляют субстрат Флуорофоса® и буферный раствор субстрата до достижения комнатной температуры. Добавляют содержимое одной пробирки с буферным раствором субстрата (240 см) к содержимому одной пробирки Флуорофоса® (144 мг) (см. 5.1) и хорошо перемешивают, переворачивая в течение 3 мин. Используют желтое стекло для защиты против света.

Перед использованием полученный раствор выдерживают при комнатной температуре как минимум 30 мин.

Используют аналого-цифровой тест, описанный в 9.4.1.1, для проверки устойчивости готового к использованию субстрата.

Рабочий субстрат остается стабильным в течение 60 дней, если он защищен от света и хранится при температуре от 2 °С до 8 °С, или в течение 8 ч, если хранится при 38 °С. Не следует использовать рабочий субстрат, если получено показание выше 1200.

Примечание - Полученный объем рабочего субстрата (240 мл) является достаточным приблизительно для 115 тестов.

5.4 Рабочие калибровочные растворы, Флуорожелтый® (FY), 2'-[2-бензотиазолил]-6'-гидроксибензотиазол в буферном растворе DEA.

Рабочие калибровочные растворы остаются стабильными в течение 18 мес, когда их хранят при температуре от 2 °С до 8 °С.

5.4.1 Калибровочный раствор А, содержащий 0 мкмоль/дм Флуорожелтого®.

5.4.2 Калибровочный раствор В, содержащий 17,24·10 мкмоль/дм Флуорожелтого®.

5.4.3 Калибровочный раствор С, содержащий 34,48·10 мкмоль/дм Флуорожелтого®.

5.5 Раствор для ежедневного контроля прибора, содержащий 34,48·10 мкмоль/дм Флуорожелтого®.

     6 Аппаратура

6.1 Фильтрованный флуориметр с термостатически регулируемым держателем кюветы при поддержании температуры (38±1) °С и правоугольной оптической системой, допускающей возбуждение при длине волны 440 нм и испускание при 520-560 нм (например, прибор Флуорофос).

Измерения должны быть оптимизированы согласно инструкциям изготовителей.

6.2 Кюветы сменные, из нефлуоресцентного стекла, диаметром 12 мм и длиной 75 мм.

6.3 Пипетки.

6.3.1 Дозатор фиксированного объема, дозирующий по 2,0 см.

6.3.2 Пипетка вытеснительного типа или нагнетательная вместимостью 0,075 см.

6.3.3 Пипетка вместимостью 2 см.

6.4 Инкубаторный блок, поддерживающий температуру (38±1) °С, подходящий для помещения в них кювет.

6.5 Парафильм* или другая подходящая пленка лабораторного класса.

_________________

* Парафильм является примером подходящего продукта, выпускаемого в промышленности.

6.6 Вихревая мешалка.

6.7 Водяная баня, поддерживающая температуру (63±1) °С и (95±1) °С.

6.8 Мерные колбы с одной меткой вместимостью 100 см.

     7 Отбор проб

В лабораторию должна быть отправлена представительная проба. Ее следует оберегать от повреждений во время транспортирования или хранения.

рекомендуется Отбор проб проводить по ГОСТ Р 26809 и [1].

     8 Подготовка к испытанию

8.1 Молоко, не содержащее щелочной фосфатазы

Приготовляют молоко без фосфатазы для испытания, тщательно дозируя требуемую порцию молока в пробирку или подходящий контейнер, следя, чтобы оно не касалось краев или стенок контейнера.

Помещают пробирку или контейнер с образцом молока в водяную баню, установленную на 95 °С, нагревают до 95 °С и продолжают его подогрев в течение 5 мин при этой температуре. Температуру контролируют термометром или термисторным зондом, помещенным в центр пробирки или контейнера. Затем образец быстро охлаждают.

Таким образом, обработанный образец молока тестируют, чтобы удостовериться, что активность щелочной фосфатазы меньше 10 мЕ/л.

8.2 Приготовление образца для испытаний

8.2.1 Общие вопросы

Перед использованием все испытуемые образцы тщательно перемешивают, не нагревая.

8.2.2 Пастеризованные испытуемые образцы

Пастеризованные испытуемые образцы используют в состоянии после поставки в требуемых количествах.

8.2.3 Разбавление испытуемых образцов с высокими значениями ALP

Приготовляют разбавленные образцы молока, используя молоко без фосфатазы, для того чтобы их уровни активности щелочной фосфатазы ALP соответствовали аналитическому диапазону испытания (<2000 мЕ/л). Разбавленные растворы хорошо перемешивают.

     9 Проведение испытаний