МУК 4.1/4.2.588-96 Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям

6. Контроль содержания примесей клеточных ДНК в биотехнологических препаратах

Настоящему испытанию подлежат генно-инженерные препараты, моноклональные антитела и биотехнологические продукты, получаемые на перевиваемых клеточных линиях, предназначенные для введения людям. В частных фармакопейных статьях на отдельные препараты, учитывая их специфические характеристики и особенности производства, возможно внесение соответствующих изменений при проведении данного контроля.

Испытание проводят на полуфабрикате препарата (очищенного продукта) до добавления каких-либо стабилизаторов, наполнителей, консервантов и других компонентов, которые могут входить в состав конечной лечебной формы.

Выделение ДНК из клеток штамма продуцента

1 г биомассы клеток штамма продуцента суспендируют в 20 мл буфера ТЕ, добавляют 10%-ный раствор додецилсульфата натрия (SDS) до конечной концентрации 1%, лизируют в течение 15 мин, перемешивая. К полученному лизату добавляют равный объем смеси фенол-хлороформ (1:1). Смесь встряхивают в течение 15 мин, центрифугируют при 5000 об./мин в течение 5 мин, собирают верхний слой (без интерфазы) и повторяют экстракцию фенол-хлороформом еще дважды. Собирают верхний слой, добавляют раствор 5 моль/л ацетата аммония до конечной концентрации 0,25 моль/л и 2-2,5 объема охлажденного до -20 °С этилового спирта. Полученную смесь оставляют на 1 час при -20 °С (можно оставить на ночь - 14-16 часов), затем центрифугируют при 5000 об./мин в течение 5 мин. Этиловый спирт сливают, осадок подсушивают на воздухе и растворяют в 1,5 мл буфера ТЕ. К раствору ДНК добавляют раствор РНК-азы (10 мг/мл) до конечной концентрации 50 мкг/мл. Смесь выдерживают при периодическом помешивании в течение одного часа при 37 °С, после чего к ней добавляют сухую лиофилизированную протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл. Смесь инкубируют, периодически помешивая, в течение 30 мин при 37 °С, затем депротеинизируют равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) и далее равным объемом хлороформа. К водной фазе добавляют раствор 5 моль/л ацетата аммония до конечной концентрации 0,25 моль/л и 2 объема охлажденного до -20 °С этилового спирта. Выпавший осадок ДНК собирают центрифугированием, промывают в 70%-ном растворе этанола, подсушивают при комнатной температуре до удаления остатков этанола и растворяют в 2 мл буфера ТЕ.

Измерение концентрации ДНК

Концентрацию ДНК определяют спектрофотометрически при длине волны 256 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. 30 мкл раствора ДНК разводят буфером ТЕ до 3,0 мл, помещают в кювету спектрофотометра и определяют оптическую плотность раствора. В качестве контроля используют буфер ТЕ. Концентрацию полученного раствора ДНК (, мкг/мл) вычисляют по формуле:

,

где:

- оптическая плотность раствора при длине волны 256 нм;

- 50 мкг/мл (при такой концентрации оптическая плотность раствора ДНК при 256 нм равна одной оптической единице);

- кратность разведения исследуемого раствора, в данном случае равная 100.

Пример расчета: в результате спектрофотометрического анализа раствора ДНК установлено, что оптическая плотность раствора при 256 нм составляет 0,2 оптической единицы. Тогда:

мкг/мл (1 мг/мл).

Критерием чистоты препарата ДНК является соотношение значений оптической плотности раствора ДНК при длинах волн 256 и 280 нм. Для чистых препаратов ДНК указанное соотношение выше 1,7. Например, светопоглощение исследуемого разведенного раствора ДНК при 280 нм равно 0,11 оптической единицы. Тогда соотношение 256/280 равно 0,20/0,11=1,81.

Полученный препарат очищенной клеточной ДНК в дальнейшем используют для приготовления меченой ДНК-зонда и построения калибровочного графика.

Получение меченой ДНК

В пробирку для микропроб вносят 2,0 МБк Р-дезоксиаденозинтрифосфата (удельная радиоактивность 8-12х10 МБк/ммоль).

Затем пробирку помещают в ледяную баню и вносят следующие компоненты реакции: 5 мкл буфера для ник-трансляции, 1 мкг ДНК клеток штамма-продуцента, 1 мкл раствора дезоксицитидинтрифосфата, тимидинтрифосфата и дезоксигуанозинтрифосфата в концентрации 1 моль/л и деионизованную воду до 45 мкл. Раствор ДНК-азы 1 (1 мг/мл) разводят деионизованной водой в 10000 раз и 0,5 мкл полученного раствора вносят в реакционную смесь. Далее добавляют 15 ед. ДНК-полимеразы 1 E.coli и смесь тщательно перемешивают. Реакционную смесь инкубируют в течение 2-х часов при температуре 15 °С. Реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь 2 мкл раствора ЭДТА концентрации 0,5 моль/л.

Определение удельной радиоактивности меченой ДНК

На 2 нитроцеллюлозных фильтра диаметром 2 см наносят по 1 мкл реакционной смеси. Один фильтр дважды отмывают в 20 мл холодного 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты в течение 5 мин, далее 2 мин в 10 мл этанола и высушивают при комнатной температуре. Оба фильтра помещают в сцинтилляционные флаконы для определения радиоактивности, наливают во флаконы по 4 мл толуолового сцинтилляционного раствора и определяют на счетчике количество импульсов в минуту. По полученным данным определяют процент включения метки, рассчитывают общую радиоактивность в 50 мкл реакционной смеси и, соответственно, удельную радиоактивность ДНК, т.е. количество импульсов в минуту на 1 мкг ДНК. Удельная радиоактивность ДНК должна быть не менее 2,0х10 имп./мин. Для реакции гибридизации необходимо взять (2+/-0,5)х10 имп./мин на 1 мл гибридизационной смеси.

Очистка меченой ДНК

Предварительно готовят суспензию сефадекса G-25. Носик наконечника автоматической пипетки, вместимостью 1,0 мл, закрывают небольшим кусочком стекловаты и заполняют суспензией сефадекса. В полиэтиленовую центрифужную пробирку помещают пробирку для микропроб типа "Эппендорф", вместимостью 1,5 мл, а в нее наконечник пипетки с сефадексом. Пробирку центрифугируют при 18000 об./мин в течение 2,5 мин. Сефадекс в наконечнике еще раз промывают буфером ТЕ, содержащим 20 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Жидкость из эппендорфовской пробирки удаляют, в наконечник на гель наносят реакционную смесь с меченой ДНК и опять центрифугируют в том же режиме. Не включившиеся в ДНК меченые и немеченые нуклеозидтрифосфаты остаются в геле, меченая ДНК собирается на дне пробирки в объеме 50 мкл.

Иммобилизация ДНК на мембране

К полуфабрикату исследуемого препарата, объемом 0,5 мл, добавляют 1 мкл раствора ДНК спермы лосося концентрации 20 мг/мл, затем дважды проводят депротеинизацию равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1), собирают водный слой после центрифугирования в течение 5 мин при 5000 об./мин и осаждают двумя объемами этанола в присутствии ацетата аммония в конечной концентрации 0,3 моль/л. Пробы выдерживают 1 ч при температуре -20 °С (можно оставить на ночь - 14-16 часов). Осажденные нуклеиновые кислоты собирают центрифугированием при 13000 об./мин в микроцентрифуге в течение 6 мин. Супернатант осторожно сливают, в пробирки с осадками нуклеиновых кислот добавляют 50 мкл 0,5 моль/л раствора гидроокиси натрия и выдерживают 20 мин при температуре 18-25 °С. Пробы нейтрализуют на холоду равным объемом (50 мкл) нейтрализующего раствора и помещают в ледяную баню. Далее на нижнюю часть аппарата для дот-гибридизации кладут смоченную дистиллированной водой фильтровальную бумагу, на нее помещают мембрану Hybond-N ("Амершам") и прижимают верхней частью аппарата, снабженной специальными зажимами. Верхняя часть аппарата для дот-гибридизации представляет собой пластину (132х100х18) с лунками. Исследуемые образцы вносят в лунки А (1-12) и в следующие ряды в зависимости от количества исследуемых проб.

Параллельно, рядом с исследуемыми образцами, наносят ряд известных разведений очищенной клеточной ДНК в концентрации от 20 нг до 0 пкг. Разведения готовят с помощью буфера ТЕ, содержащего ДНК-носитель (20 мкг/мл ДНК спермы лосося) следующим образом. В 8 пробирок для микропроб добавляют по 100 мкл буфера ТЕ, содержащего 20 мкг/мл ДНК носителя. Раствор ДНК штамма-продуцента разводят до концентрации 100 мкг/мл и 5 мкл этого раствора ДНК разводят до 500 мкл раствором ТЕ с 20 мкг/мл ДНК-носителя. Таким образом получают раствор с концентрацией 1000 нг/мл. 25 мкл этого раствора (25 нг) добавляют в первую пробирку, тщательно перемешивают, отбирают 25 мкл полученного раствора (5 нг) и переносят во вторую пробирку, тщательно перемешивают и отбирают 1/5 часть раствора (25 мкл, содержащие 1 нг ДНК) и переносят в третью пробирку, тщательно перемешивают. Таким образом разводят до восьмой пробирки. В восьмую пробирку ДНК не добавляют. В табл.1 представлены концентрации стандартного ряда ДНК в 1-8 пробирках.

Таблица 1

Концентрации стандартного ДНК в пробирках