Методические рекомендации. Обнаружение и идентификация Pseudomonas Aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)

2. Питательные среды

2.1. Питательные среды обогащения первого этапа. Различны в зависимости от исследуемого объекта, их выбор определяется уровнем и составом усвояемых компонентов в исследуемом объекте.

2.1.2. Минеральная среда Бонде (модификация). Трехзамещенного цитрата натрия 0,28 г, фосфата натрий-аммония 0,15 г, однозамещенного фосфата калия 0,1 г, сульфата магния 0,02 г, дист. воды до 100,0 мл. Стерилизация при 1 атм. 20 мин. Непосредственно перед посевом прибавить 2,0 мл 0,01% водного р-ра кристаллического фиолетового.

2.1.2. Концентрат среды Бонде. Все компоненты, кроме воды в 10-кратном размере. Концентрат прибавлять к объекту в соотношении 1:10.

2.1.3. Среда с хлоридом трифенилтетразола (ТТХ): пептона 2,0 г, дрожжевого экстракта по Г.Г.Калине* 15 мл (или сухого 0,3 г, двузамещенного фосфата калия 0,2 г, ТТХ 0,8 г, воды дист. до 100,0 мл. Стерилизация при 0,5 атм. 15 мин, рН 7,1.

2.1.4. Дрожжевой экстракт жидкий по Г.Г.Калине*.

________________

* Методические указания по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов. МЗ СССР, М., 1981 г.

2.1.5. 8% водный раствор ТТХ в дистиллированной воде. В жидкие объекты прибавляют в соотношении 1:10.

2.2. Селективно-дифференциальная среда (СДС) второго этапа.

2.2.1. Среда "Блеск". Мясопептонного стерильного 2% агара 100,0 мл, молока нормализованного 10,0 мл, 10% водного раствора трифенилтетразола хлорида 8,0 мл, L-аргинина гидрохлорида 0,3 г, в расплавленный мясопептонный агар прибавить аргинин, р-р трифенилтетразол хлорида (самостерилизуется после хранения при комнатной температуре 2-3 дня) и стерильное снятое молоко размешать, разлить в 6-7 чашек.

2.2.2. При отсутствии мясопептонного агара возможно применение упрощенного варианта среды "блеск": к 100,0 мл дистиллированной воды прибавить питательный сухой агар Дагестанского НИИ питательных сред, после стерилизации при 0,5 атм., 15 мин, внести 10,0 мл стерильного снятого молока и 8,0 мл 10% водного р-ра трифенилтетразола хлорида, смешать, разлить в 6-7 чашек. Следует учесть, что такая упрощенная среда несколько теряет в интенсивности образования блеска (вместо сплошного золотистого налета колонии содержат мелкие золотистые вкрапления или ободок по периметру колонии).

2.3. Среды и тесты идентификации.

2.3.1. Среда Кинг-А. Пептон 2,0 г, агар 1,5 г, глицерин - 1,0 г, сульфат калия 1,0 г, хлорид магния 0,14 г, вода дистиллированная до 100,0 мл рН 7,2. Стерилизация при 0,5 атм. 15 мин, разлить в 6 чашек.

2.3.3. Среда для определения оксидации мальтозы. Пептон 0,2 г, хлорид натрия 0,5 г, мальтоза 2,0 г, 1,6% спиртовой или щелочной раствор бромтимолового синего 1,0 мл, вода дистиллированная до 100,0 мл рН 7,2. Стерилизация при 0,5 атм. 15 мин, разлить в 6 чашек.

2.3.4. Среда для определения теста Хью и Лейфсона (оксидация, ферментация). Модификация в одной пробирке. Пептон 2,0 г, хлорид натрия 5,0 г, глюкоза 5,0 г, KHPO 0,3 г, агар - 4,0-6,0 г, 1,6% р-р фенолового красного 2,5 мл, вода 1000,0 мл. После растворения в водяной бане или автоклаве разлить в пробирки ровно высотой столбика 6 см (независимо от диаметра пробирки), стерилизовать при 0,5 атм. 15 мин, застудить столбиком.

2.3.5. Среда для определения нитрат-нитритредуктазы и роста при 42 °С. Пептон 2,0 г, хлорид натрия 0,5 г, нитрат калия 0,2 г, агар 0,1 г, дрожжевой экстракт жидкий 20,0 мл, вода 80,0 мл (дрожжевой экстракт и вода могут быть заменены мясопептонным бульоном, в этом случае содержание пептона уменьшить до 1,0 г). После растворения компонентов в водяной бане разлить в пробирки по 4-5 мл, стерилизовать при 0,5 атм. 15 мин, застудить столбиком.

2.3.6. Реакция цитохромоксидазы по Гэби и Хедли. В СССР принят метод определения цитохромоксидазы с использованием диметилпарафенилендиамина (пара-аминодиме.....*аланина хлорида или оксалата), который в сочетании с альфанафтолом образует за счет оксидации цитохрома индофеноловый синий. 1% водный раствор реактива смешать с 1% спиртовым раствором альфа-нафтола в пропорции 2:1 непосредственно перед применением. Хранение обоих реактивов обязательно раздельно в холодильнике. Смесь реактивов наносят петлей (платиновой или нихромной, но не железной) на периферический участок макроколонии на среде Кинг-А или на изолированную колонию на среде "блеск". Пигментированные колонии на среде Кинг-А и покрытые золотистым налетом на среде "блеск" предпочтительно наносить на фильтровальную бумагу, смоченную смесью реактивов. Положительный результат - посинение колонии или мазка на фильтровальной бумаге в течение 20-40 секунд. Позднюю реакцию, как и посинение агаровой среды, не учитывать.

________________

* Брак оригинала. - Примечание изготовителя базы данных.

2.3.7. Тест Грегерсена. Простой, быстрый способ, заменяющий окраску по Граму и не требующий оптики. В капле 3% водного р-ра KОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры или колонии к грам-отрицательному виду. У грам-положительных микробов, за редкими исключениями, реакция отрицательна.