7.1. Подготовка проб для анализа
Отбор образцов для анализа ведется в соответствии с п.3 данного документа. Образцы, предназначенные для анализа, должны храниться в холодильнике, в темном месте.
7.1.1. Подготовка проб молока
Молоко объемом 5 см
охладить до температуры 6±2 °С, перенести в центрифужную пробирку, центрифугировать при температуре 4-10 °С в течение 15 мин при эффективности центрифугирования 4000 g*. Удалить верхний слой жира и перенести аликвоту обезжиренного молока в новую чистую пробирку. Смешать обезжиренное молоко с буфером N 1 в соотношении 1:10. Для анализа использовать 0,05 см разведения обезжиренного молока с буфером на 1 лунку планшета. Коэффициент разбавления - 10.
________________
* Эффективность центрифугирования измеряется в g и зависит от скорости и радиуса вращения (см. технический паспорт имеющейся центрифуги). Например, при использовании центрифуги ОПН-8 с угловым ротором эффективности 4000 g соответствует скорость вращения ротора около 7000 об/мин.
7.1.2. Подготовка проб мяса
7.1.2.1. Приготовление реагентов для пробоподготовки
При исследовании образцов мяса для пробоподготовки необходимо приготовить следующие реагенты:
метанол (допускается использование спирта этилового 95,0%);
буфер Макллвейна: 12,9 г лимонной кислоты моногидрата; 10,9 г Na
HPO
; 37,2 г ЭДТА-натриевой соли растворить в дистиллированной воде и довести до объема 1000 см; установить рН 3,8;
раствор 20 мМ щавелевой кислоты в метаноле (этаноле) (1,8 г/л).
7.1.2.2. Приготовление проб
Пробу мяса измельчить с использованием лабораторного гомогенизатора. Далее 5 г гомогенизированной пробы поместить в чистую центрифужную пробирку, смешать с 25 см буфера Макллвейна и встряхивать в шейкере в течение 30 мин. Полученную суспензию охладить до температуры 15 °С и центрифугировать в течение 10 мин при эффективности центрифугирования 4000 g. Отобрать пипеткой верхний слой в чистую пробирку и повторить с оставшейся пробой экстракцию с 25 см буфера Макллвейна. После этого объединить супернатанты (50 см) и профильтровать раствор через гофрированный фильтр.
7.1.2.3. Очистка раствора методом твердофазной экстракции
Из полученного по п.7.1.2.2 фильтрата отобрать 5 см и очистить раствор методом твердофазной экстракции на колонке RIDA
С18 следующим образом:
предварительно колонку промывают 3 см метанола (этанола) со скоростью 1 капля в секунду: при отсутствии устройства для твердофазной экстракции можно использовать разовый пластиковый шприц на 5 см;
промыть колонку 2 см дистиллированной воды со скоростью 1 капля в секунду;
пропустить через колонку 5 см подготовленного раствора исследуемой пробы со скоростью 15 капель в минуту;
промыть колонку 3 см дистиллированной воды со скоростью 1 капля в секунду;
удалить из колонки остатки жидкости и сушить колонку в токе воздуха или азота 2 мин;
адсорбированные на колонке вещества осторожно, со скоростью 15 капель в минуту, элюировать 2 см 20 мМ раствора щавелевой кислоты в метаноле (этаноле) в чистую пробирку;
элюат разбавить буфером N 1 в 10 раз (1:9), например, смешав 0,05 см элюата и 0,45 см буфера N 1. Раствор готов к испытанию в ИФА. Для анализа используют 0,05 см раствора.
7.2. Приготовление реагентов для анализа
